Deteccióndealérgenos de cacahuete…
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Comoanalitoseseleccionóunasecuenciade86-‐merquecodificapartede la
proteína Ara h 2, característica del cacahuete y cuya especificidad se comprobó
medianteel programaBLAST(21).
Se seleccionó una sonda de captura de 32 bases tiolada en el extremo 5´,
complementariaensu totalidadconpartedel analitoyuna sonda indicadorade54
nucleótidos funcionalizada en su extremo 3’ con biotina. La sonda de captura se
diseñó de forma que hibride con la parte del analito que queda libre en la
hibridación con la sonda indicadora, formando las tres hebras un dúplex perfecto.
Deesta forma, seevitaquealgunabasequede sinhibridar ydé lugar aadsorciones
inespecíficas sobreel electrodoypor tantoaerroresen lamedida.
Parapredecir lasposiblesestructuras secundariasde las sondasy laenergía
de hibridación del analito con la sonda de captura e indicadora se utilizó el
programa informáticoMfoldwebServer (22). Laestructura secundariade la sonda
de capturapresentauna energía libre
Δ
G= -‐2,9kcal/mol, ladel analitoΔG= -‐16,71
kcal/mol, la de la sonda indicadora ΔG = -‐4,39 kcal/mol, el híbrido analito-‐sonda
de captura presenta una energía libre ∆G = -‐49,8 kcal/mol y el híbrido analito-‐
sonda indicadora ∆G = -‐85,5 kal/mol. Estos datos demuestran la hibridación
espontáneadel analitocon lasdos sondas.
3.2. Selecciónde lascaracterísticasdel diseñodeexperimentos
En la ejecución de un diseño de experimentos resulta de gran importancia
identificar adecuadamente los factores o variables independientes que pueden
afectar a la respuesta (variable dependiente) así como sus niveles experimentales.
Una selecciónerróneadeestosnivelespodríadar lugar a respuestasmuysimilares
que no se deberían a la no influencia del factor sobre la respuesta sino
simplemente a que el factor no afecta en la zona de trabajo, pero puede hacerlo si
seamplíadichazona.
Se comenzó por optimizar la composición de la monocapa, considerando
como factores las concentraciones de sonda de captura y demercaptohexanol. Al
seleccionar los niveles, hay que intentar conseguir una SAM homogénea y no
demasiado compacta de forma que se permita el contacto entre las hebras
complementarias (23).
Experiencias previas demostraron que una concentración de sonda de
captura inferior a 0,1 µM producía defectos en la monocapa quedando zonas de
oro no cubiertas. Por otra parte, se requiere un exceso de sonda de captura en
relación al híbrido analito-‐sonda indicadora con el fin de asegurar que todo el
analito incorporado va a poder reaccionar con la sonda de captura para formar el
híbrido final. Teniendo esto en cuenta se consideraron como límites
experimentales0,1y2µM.
