Deteccióndealérgenos de cacahuete…
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utilizados sin purificación previa. El etanol y el ácido sulfúrico fueron adquiridos
enPanreac (España).
Las disoluciones tampón utilizadas en la preparación del sensor fueron:
i
)
disolución tampónde inmovilización e hibridación formada por 2×SSPEpH7,4;
ii
)
disolución tampón de bloqueo consistente en 5×SSPE pH 7,4 + 5% BSA + 0,1%
Tween20; y
iii
)disolucióntampóndemedidacompuestapor0,5MTris-‐HCl pH9,8
+1mMdeMgCl
2
+0,1MdeKCl.
Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas fueron suministradas por
Sigma-‐Life Science (Reino Unido). Dichas disoluciones se reconstituyeron en agua
Milli-‐Qysealmacenarona -‐20ºChastasuuso.
2.2. Instrumentación
Las medidas electroquímicas se realizaron en un potenciostato Autolab
PGSTAT12, controladopor el softwareGPES4.9005 (EcoChemieB.V, Holanda). Se
utilizaron electrodos serigrafiados de oro (referencia 220BT; DropSens, España)
que constan de una configuración de tres electrodos impresos en una lámina de
alúmina, un electrodo de trabajo (diámetro 4mm) y un electrodo auxiliar, ambos
de oro, y un electrodo de pseudo-‐referencia de plata. La celda electroquímica está
limitada por un anillo formado por un polímero aislante que rodea a los tres
electrodos y tiene un volumen máximo de 50
µ
L. Todos los experimentos se
llevaron a cabo a temperatura ambiente utilizándose un electrodo para cada
medida. Las medidas de pH se realizaron en un pH-‐metro Crison micropH 2001
(España). Para lacuantificacióndel ADNseutilizóunespectrofotómetroUV-‐visible
Cary300Bio(AgilentTehcnologies, EstadosUnidos).
2.3. Procedimientoexperimental
2.3.1.Diseñodel sensordeADN
Como todos los biosensores, los genosensores o sensores deADNcombinan
un elemento de reconocimiento biológico, que en este caso es una secuencia de
oligonucleótidos denominada sonda, con un transductor encargado de la medida
de la reacción de hibridación entre la sonda y el analito. La sonda utilizada será
complementaria a la secuencia de ADNde interés (analito) y formarán un híbrido
de Watson-‐Crick con extrema selectividad incluso en presencia de sondas de
oligonucleótidosnocomplementarias.
La preparación del sensor comienza por la formación de una monocapa
autoensamblada (SAM) sobre la superficie del electrodo de oro. Antes de su
utilización, los electrodos serigrafiados de oro se sometieron a un proceso de
limpieza que consistió en lavado con etanol y agua Milli-‐Q seguido de un
pretratamientoelectroquímicode25barridos cíclicos entre0y+1,6V, a100mV/s,
enH
2
SO
4
0,1M, paraeliminar los residuosdel procesode fabricación, yasímejorar
lasensibilidadyreproducibilidadde los resultados (16).
