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Para la preparación del extracto proteico de las muestras de corazón se
homogeneizaron unos 50 mg de miocardio congelado de cada uno de los animales
(RIPA buffer (#R0278, Sigma-Aldrich) con inhibidores de proteasas y un sistema
específico de homogeneizado (Fast Prephomogenizer). Después de 20 minutos de
centrifugación a 30.000 g, la parte insoluble de la muestra fue descartada y el
sobrenadante almacenado a -80ºC para posteriores estudios bioquímicos. Para el
estudio de la expresión de proteínas, se cargaron 50 µg de proteína junto con
tampón de carga (40% β-mercaptoetanol, 8% SDS, 40% glicerol, 0,025% azul de
bromofenol, and 0,25 mmol/L Tris, pH 6,4), y se llevó a cabo la separación de las
proteínas por electroforesis en geles de acrilamida al 12%. Una vez separadas las
proteínas, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubó durante
toda la noche y a 4ºC con los anticuerpos específicos contra las proteínas que
queríamos estudiar (Cell Signaling), anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2), p44/42
MAPK (Erk1/2), phospo-Akt (Thr308), and Akt (Thr308). La dilución usada para
todos ellos fue 1:1000. Tras varios lavados con TBST, se las membranas se
incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 1 hora
a 4ºC (#RPN4301, Amersham) a una dilución. Un anticuerpo monoclonal anti-
GAPDH (#G8795, Sigma-Aldrich) se usó como control de carga. Para la
visualización de las bandas en las películas autorradiográficas utilizamos el
sustrato quimioluminiscente ECL-Plus (#RPN2132, Amersham). Las películas
fueron densitometradas y analizadas con el programa Image J.
2.10. Análisis estadístico
Los resultados están expresados como la media ± error estándar. La
comparación entre ambos grupos, cerdos tratados con Fingolimod y grupo control,
se realizó con el test t-test para las medidas tomadas en un único tiempo. Para
aquellas medidas tomadas a una semana y a un mes después de la inducción del IM,
los datos se analizaron mediante una ANOVA de medidas repetidas seguidos de un
análisis post-hoc Tukey para determinar si había diferencias entre los grupos.
Todos los análisis se realizaron con el programa estadístico SPSS 18.0 (SPSS Inc.,
Chicago, Illinois). Únicamente fueron consideradas significativas aquellas con una
p < 0,05.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La activación de S1P-R con Fingolimod en el periodo pre-reperfusión redujo la
apoptosis de los cardiomiocitos en la zona isquémica 24 horas después del IAM
La activación de S1P con Fingolimod dio lugar a una reducción significativa
del número de núcleos positivos para la tinción de TUNEL indicando una
disminución de la apoptosis de los cardiomiocitos (Figura 1A-B) en el grupo
Fingolimod. La técnica de Western blot confirma estos resultados pues se observa
