Efectos cardioprotectores de reducción de tamaño del infarto de miocardio…
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hemodinámicas entre grupos. A través de la arteria femoral, introdujimos un
microcatéter de tipo Millar de 7F (Millar Instruments Inc., Houston, TX) hasta el
ápex del VI y tomamos durante las siguientes medidas: presión sistólica, presión al
final de la diástole, tasa máxima de cambio de la presión en el VI (dP/dt) máx, y
trabajo cardiaco; el índice de contractilidad fue calculado como (dP/dt) máx /
(presión telesistólica de VI – presión telediastólica de VI). Cada parámetro se
calculó a partir de la media de, al menos, tres ciclos cardiacos consecutivos.
2.7. Niveles plasmáticos de metanefrinas
Se tomaron muestras de plasma quince minutos tras la inserción del
introductor arterial y teniendo al animal anestesiado y en un estado de reposo. Los
niveles de metanefrinas se determinaron utilizando un método de ELISA (Rocky
Mountain Diagnostics Colorado Springs, Co).
2.8. Análisis histológico
Los corazones incluidos en OCT se cortaron a 8 µm y fueron usados para
analizar fibrosis y tamaño de los cardiomiocitos en el tejido miocárdico remoto, no
isquémico y para la determinación de la apoptosis en el tejido del borde del infarto.
Para analizar el tamaño celular, se realizó una inmunohistoquímica para vinculina
(#V9131, Sigma-Aldrich). Para ello utilizamos tres cortes de cada muestra que
fueron permeabillizados y bloqueados con Triton 0,3% y con BSA 1%
respectivamente. El anticuerpo primario anti-vinculina a una dilución 1:100 fue
incubado durante toda la noche y a 4ºC. Tras varios lavados con PBS, los cortes
fueron incubados con el anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse
(#A11001, Invitrogen) a una dilución 1:500 durante 1h a temperatura ambiente.
Tras varios lavados con PBS, las preparaciones se montaron con medio de montaje
con DAPI (#H-1500, Vector Lab) y se tomaron imágenes digitales (microscopio
Zeiss Axioplan2 y el programa Zeiss Axio Vision, Micro-optik). El área y tamaño de
los cardiomiocitos fueron cuantificados con el programa Image J (National
Institutes of Health, Bethesda, MD).
Para la determinación de la fibrosis intersticial, se tiñeron 3 cortes de cada
muestra con Rojo Sirio (Spectrum Chemical) de acuerdo con las especificaciones de
la casa comercial. Las imágenes fueron realizadas con luz polarizada (microscopio
Zeiss Axioplan2 y el programa Zeiss Axio Vision (Micro-optik)). Se cuantificó y
analizó el área del miocardio positiva para esta tinción con el programa Image Pro
Plus.
Para la determinación de la apoptosis celular vía fragmentación del DNA se
utilizó un kit ensayo comercial de TUNEL (ApoTag® Florescein
In Situ
Apoptosis
Detection Kit, Millipore) siguiendo el protocolo del manual. Para las
cuantificaciones se analizó un mínimo de 10 campos con un objetivo 20X por corte.
2.9. Expresión de proteínas
