Estudiode laactividadneuroprotectoradediterpenos…
367
incubación, las células se lavan 2 veces conmedio de Krebs sin calcio y sin sonda
fluorescente y se dejan incubar durante 30minutos a lamisma temperatura para
permitir lahidrólisis completadel éster. La fluorescencia semidea37ºCdurante5
minutos a una λexcitación de 552 nmy a una λemisión de 581 nm a 37ºC en un
fluorímetro Spectramax Gemini EM (Molecular Devices). A continuación, se
adiciona el ionóforoA23187 (5μM) y semide la fluorescenciadurante15minutos
en lasmismas condicionesdescritasanteriormente (25).
2.4.Métodosparael estudiodepasoatravésdeBHE
-‐
Estudiosdepermeabilidad
. El experimentode transporte se inicia con la
adición de los diterpenos en un volumen de 0,5 mL en el compartimento apical
(parael transporteapical abasal) yenunvolumende1,5mLenel compartimento
basal (para el transporte basal a apical). Las placas se incuban a 37ºC en agitación
durante6h. Unavez finalizadoel transporte, se tomanalícuotasde los lados apical
ybasal, parasuposterioranálisisycuantificaciónporHPLC(26).
3. RESULTADOSYDISCUSIÓN
Enel presente trabajodeTesis, seha evaluado la actividadneuroprotectora
de seis diterpenos andalusol, conchitriol, lagascatriol, foliol, linearol y sidol
aislados del género
Sideritis
frente al estrés oxidativo inducido por exposición a
H
2
O
2
en los modelos celulares PC12 (modelo neuronal) y U373-‐MG (modelo de
astrocitoma).
Para llevarlo a cabo hemos establecido, en primer lugar, las condiciones de
dañooxidativoparapasarposteriormenteadeterminar si lasmoléculas enestudio
protegen frente almismo. En el estudio sobre protección celular se ha evaluado el
efecto sobre la viabilidad celular, los cambios sobre lamorfología celular, el nivel
de ROS intracelular, los cambios sobre los marcadores de estrés oxidativo
(peroxidación lipídica y ratio GSH/GSSG) y sobre la actividad y expresión de las
proteínas de las principales enzimas antioxidantes implicadas en el sistema de
defensa. El efecto de los diterpenos sobre diferentes marcadores de disfunción
mitocondrial como son los niveles de calcio citosólico ymitocondrial, el potencial
demembranamitocondrial y los niveles de ATP también han sido evaluados. Los
posibles mecanismos implicados en la protección de los diterpenos en estudio
frente al daño celular inducido por H
2
O
2
han sido asimismo elucidados.
Finalmente, se ha realizado el estudio y posible mecanismo de paso de los
diterpenosa travésde laBHE.
En el presente resumen de Tesis Doctoral se muestra sólo una pequeña
partede los resultadosobtenidos.
El H
2
O
2
ha sido la molécula utilizada como agente generador de estrés
oxidativo. La formaciónde elevadas concentraciones deH
2
O
2
se ha descrito en las
