Estudiode laactividadneuroprotectoradediterpenos…
365
2.2. Líneascelulares
2.2.1. Líneas celulares utilizadas en los estudios de estrés oxidativo y
disfunciónmitocondrial. Tratamientocelular.
LíneacelularPC12(Neuronas)
La línea celular PC12 se adquirió de la colección de cepas American Type
Culture Collection (ATCC). El medio de cultivo utilizado es Dulbecco’s Modified
Eagle’sMedium (DMEM) (Gibco, Invitrogen Corporation) suplementado con 0,5%
de gentamicina (Gibco, Invitrogen Corporation) y 0,2% de piruvato (Sigma-‐
Aldrich). Las células semantienen a 37ºC en atmósfera de aire al 95%y de CO
2
al
5%.
LíneacelularU373-‐MG(Astrocitos)
La línea celularU373-‐MGse adquiriódesde Sigma-‐Aldrichprocedentede la
Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC). El medio de cultivo
empleado es Dulbecco’sModifiedEagle’s Medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen
Corporation) suplementado con 0,5% de gentamicina (Gibco, Invitrogen
Corporation) ysuero fetal bovino(FBS) (Gibco, InvitrogenCorporation).Las células
semantienenencondicionesde temperaturayatmósferahúmedade37ºC, 95%de
airey5%deCO
2
.
Tratamientocelular
Las células U373-‐MG y PC12 se tratan con los diterpenos objeto de estudio
(diferentes concentraciones segúnel propiodesarrollode laTesis) durante24h, y
posteriormente con H
2
O
2
(1 mM para las células U373-‐MG y 0,1 mM para las
célulasPC12)durante30minutos.
2.2.2. Líneas celulares utilizadas en los estudios de paso a través de Barrera
HematoEncefálica(BHE)
LíneacelularRBE4
Las células RBE4 fueron cedidas por el Dr. Pierre Olivier Couraud del
Instituto Cochin del Instituto Nacional de la Salud y de la Investigación Médica
(INSERM) de París (Francia).Las células RBE4 crecen en frascos de cultivo
tapizados durante al menos 3 horas con 3 mL de una solución de colágeno
obtenida a partir del tendón de cola de rata. Las células se mantienen en una
atmósfera de 95%de aire y5%de CO2, saturada de humedad a 37ºC. Elmediode
cultivo empleado es Hams F-‐10/α-‐Minimum Essential Medium (α-‐MEM) (1:1)
(Gibco, Invitrogen Corporation), suplementado con Glutamax (Sigma-‐Aldrich),
10% de suero fetal de ternero (Gibco, Invitrogen Corporation), geneticina (300
μg/mL) (Sigma-‐Aldrich) y factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF, 1
ng/mL) (Boehringer).
