E.M. González-‐Burgos&al.
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LíneacelularECV304/C6
La línea celular ECV304 corresponde a células endoteliales de cordón
umbilical humano. Esta línea celular seobtuvode laColecciónEuropeadeCultivos
CelularesAnimales (ECACC).
La línea celular C6, procedente de células de glioma de rata, se adquirió de
laColecciónEuropeadeCultivosCelularesAnimales (ECACC).
En este trabajo, se emplearon sistemas de cocultivos entre las líneas
celulares ECV304 y C6.Estas células crecen enmedioM199 (Sigma) suplementado
con Glutamax (Sigma-‐Aldrich), 10% de suero fetal de ternero (Gibco, Invitrogen
Corporation) y penicilina/estreptomicina (100 U/mL; 100 μg/mL) (Gibco,
Invitrogen Corporation). Las células se mantienen en atmósfera húmeda de 5%
CO2/95%airea37ºC.
2.3.Métodosparael estudiodeestrésoxidativoydisfunciónmitocondrial
Enel presente resumendeTesisDoctoral semuestraunapequeñapartede
losmétodosempleadosenel estudiodeestrésoxidativoydisfunciónmitocondrial.
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Medida de la generación intracelular de radicales libres
: Técnica de
diclorofluoresceína (DCFH-‐DA) (19). Tras los tratamientos, se añaden 200
μL/pocillodeunamezcladeuna soluciónde0,01mMDCFH-‐DAconPBSglucosado
(180mgglucosa/100mLPBSestéril) ysemantiene laplacaen incubacióndurante
30minutos a37ºC. Despuésdeeste tiempo, las células se lavancon200μL/pocillo
de PBS glucosado y se procede a la lectura utilizando un Fluorímetro Lector de
microplacas FLx800, BioTek, Instruments, Inc., en las condiciones de lectura de
excitación480nmydeemisión510nm.
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Determinación de la peroxidación lipídica
(20). Para la cuantificación
de laperoxidación lipídica semiden losnivelesdeMDApresentes encadamuestra
mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), siguiendo un protocolo
modificadodeGrottoet al. (2007).
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Determinaciónde laactividady expresiónde enzimas antioxidantes.
Las enzimas estudiadas han sido aquellas implicadas en los principales procesos
de detoxificación de ROS: catalasa (21), superóxido dismutasa (22), glutatión
reductasa (23) y glutatión peroxidasa (24). Se ha determinado tanto la actividad
por técnicas espectofotométricas así como la expresión proteica de cada una de
ellasmedianteWesternblot.
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Determinaciónde los niveles de calciomitocondrial
. La concentración
de calciomitocondrial se determinamidiendo la fluorescencia de Rhod-‐2.Después
de los tratamientos, las células se lavan conmediodeKrebs con calcio y sin sonda
fluorescente, y a continuación se incubandurante 40minutos a 37ºCenoscuridad
con medio de Krebs con calcio y con la sonda fluorescente. Después de la
