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Enzymatic synthesis of fructooligosaccharides that stimulate the gut microbiota
transglutaminasa se compró a la empresa japonesa mediante cromatografía de intercambio aniónico con un
Ajinomoto con el nombre comercial de Activa WM. El detector amperométrico de pulsos (HPAEC-PAD). Los
alginato sódico (Protanal LF 120 LS) se adquirió de FMC oligosacáridos se analizaron empleando la columna
BioPolymer (USA). Todos los reactivos eran de la máxima CarboPack PA1 y los oligosacáridos y polisacáridos con la
pureza disponible en el mercado. CarboPack PA200. Cinco unidades de levansacarasa
(soluble o inmovilizada) por ml de reacción se añadieron a
2.2. Caracterización de la enzima una solución de sacarosa 600 g/l en tampón acetato sódico
50 mM pH 5.6 y se incubó a 40ºC con agitación suave. Se
La actividad catalítica de la preparación enzimática se tomaron muestras a diferentes tiempos que fueron
determinó con el método del ácido 35-dinitrosalicílico inactivadas con Na2CO3 0.4 M filtradas en tubos de
(DNS) para azúcares reductores descrito por Miller (25) centrífuga con filtros de celulosa (0.45 µm National
con sacarosa 100 g/l como sustrato. La actividad (U/mg) se Scientific) y diluidas con agua antes de ser inyectadas en el
equipo cromatográfico. Las fases móviles utilizadas para
definió como los µmol de azúcares reductores producidos cada columna se muestran en la Tabla 3. Sólo fue posible
en 1 minuto por miligramo de biocatalizador sólido la cuantificación de aquellos productos de los que se
comercial. La concentración de proteína total se determinó disponía del estándar correspondiente para realizar una
mediante el método de Bradford (26) con el reactivo de curva de calibrado. La concentración de los productos
Bio-Rad. El peso molecular de la proteína se estimó desconocidos se estimó como la diferencia entre la
analizando la preparación enzimática en un gel de cantidad inicial de sacarosa y la suma de los productos
poliacrilamida 10% con SDS teñido con Protoblue™ Safe conocidos. La actividad hidrolítica se determinó a partir de
(National Diagnosis) y comparando el tamaño de la banda la cantidad de fructosa libre. La actividad de
principal con marcadores de peso molecular de proteínas transfructosilación se calculó con la diferencia entre las
(Novagen). La transferencia a una membrana de PVDF cantidades de glucosa y fructosa libres. La tasa de
(Bio-Rad) se realizó con el Trans-Blot® Turbo™ Transfer transfructosilación/ hidrólisis se definió como el cociente
System (Bio-Rad). La membrana se tiñó con Coomassie y entre ambas actividades.
las bandas de interés se cortaron y se enviaron a un
laboratorio externo para los análisis de secuenciación del Algunos de los productos de reacción desconocidos se
dominio N-terminal. purificaron mediante HPLC semipreparativa con una
bomba Delta 600 (Waters) y un detector de índice de
Se calcularon las condiciones óptimas de pH y refracción (Varian). La columna semipreparativa era una
temperatura en términos de actividad y estabilidad. Para la
estabilidad frente al pH se prepararon las siguientes Kromasil NH2 5 µm (250 x 10 mm) y la fase móvil era
soluciones tampón: acetato sódico 50 mM a pH 3.0 3.6 acetonitrilo:agua 68:32 (v/v). Los productos aislados se
4.0 4.4 y 5.0; y fosfato sódico 50 mM a pH 5.0 6.0 7.0 y enviaron a un laboratorio externo para los análisis de
8.0. La enzima se incubó durante 24 h a 35ºC en cada uno espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear
de los tampones y se midió la actividad residual con el (RMN).
método del DNS. Para el pH óptimo la actividad en
sacarosa 100 g/l (1 ml) se midió a 35ºC durante 20 min en 2.4. Entrecruzamiento de la enzima con transglutaminasa
los tampones descritos previamente. Posteriormente se (TG)
midió la actividad por el método del DNS. Para medir la
estabilidad frente a la temperatura la enzima se incubó Para el entrecruzamiento de LEV se añadieron
durante 1 h a diferentes temperaturas entre 4-75ºC y a pH diferentes cantidades de transglutaminasa (100 U/g) a una
5.0 y la actividad residual se midió por el método del solución de LEV y se incubaron durante 1 h a 35ºC con
DNS. Para determinar la temperatura optima se incubaron agitación suave. Los productos del entrecruzamiento se
reacciones de 1 ml con sacarosa 100 g/l a diferentes visualizaron electroforéticamente en condiciones nativas y
temperaturas (25-75ºC) y pH 5.0. La actividad de cada una desnaturalizantes. La presencia de actividad se determinó
de las reacciones se midió por el método del DNS. con el reactivo cloruro de 235-tripheniltetrazolio (TTC)
tras una incubación en sacarosa siguiendo el protocolo
2.3. Identificación y cuantificación de los productos de descrito por Mukasa et al. (27). Las reacciones se dejaron
reacción toda la noche a 4ºC para observar la precipitación de
conglomerados de alto peso molecular.
La identificación de los productos de la reacción de la
levansacarasa con sacarosa como sustrato se llevó a cabo
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain 53
transglutaminasa se compró a la empresa japonesa mediante cromatografía de intercambio aniónico con un
Ajinomoto con el nombre comercial de Activa WM. El detector amperométrico de pulsos (HPAEC-PAD). Los
alginato sódico (Protanal LF 120 LS) se adquirió de FMC oligosacáridos se analizaron empleando la columna
BioPolymer (USA). Todos los reactivos eran de la máxima CarboPack PA1 y los oligosacáridos y polisacáridos con la
pureza disponible en el mercado. CarboPack PA200. Cinco unidades de levansacarasa
(soluble o inmovilizada) por ml de reacción se añadieron a
2.2. Caracterización de la enzima una solución de sacarosa 600 g/l en tampón acetato sódico
50 mM pH 5.6 y se incubó a 40ºC con agitación suave. Se
La actividad catalítica de la preparación enzimática se tomaron muestras a diferentes tiempos que fueron
determinó con el método del ácido 35-dinitrosalicílico inactivadas con Na2CO3 0.4 M filtradas en tubos de
(DNS) para azúcares reductores descrito por Miller (25) centrífuga con filtros de celulosa (0.45 µm National
con sacarosa 100 g/l como sustrato. La actividad (U/mg) se Scientific) y diluidas con agua antes de ser inyectadas en el
equipo cromatográfico. Las fases móviles utilizadas para
definió como los µmol de azúcares reductores producidos cada columna se muestran en la Tabla 3. Sólo fue posible
en 1 minuto por miligramo de biocatalizador sólido la cuantificación de aquellos productos de los que se
comercial. La concentración de proteína total se determinó disponía del estándar correspondiente para realizar una
mediante el método de Bradford (26) con el reactivo de curva de calibrado. La concentración de los productos
Bio-Rad. El peso molecular de la proteína se estimó desconocidos se estimó como la diferencia entre la
analizando la preparación enzimática en un gel de cantidad inicial de sacarosa y la suma de los productos
poliacrilamida 10% con SDS teñido con Protoblue™ Safe conocidos. La actividad hidrolítica se determinó a partir de
(National Diagnosis) y comparando el tamaño de la banda la cantidad de fructosa libre. La actividad de
principal con marcadores de peso molecular de proteínas transfructosilación se calculó con la diferencia entre las
(Novagen). La transferencia a una membrana de PVDF cantidades de glucosa y fructosa libres. La tasa de
(Bio-Rad) se realizó con el Trans-Blot® Turbo™ Transfer transfructosilación/ hidrólisis se definió como el cociente
System (Bio-Rad). La membrana se tiñó con Coomassie y entre ambas actividades.
las bandas de interés se cortaron y se enviaron a un
laboratorio externo para los análisis de secuenciación del Algunos de los productos de reacción desconocidos se
dominio N-terminal. purificaron mediante HPLC semipreparativa con una
bomba Delta 600 (Waters) y un detector de índice de
Se calcularon las condiciones óptimas de pH y refracción (Varian). La columna semipreparativa era una
temperatura en términos de actividad y estabilidad. Para la
estabilidad frente al pH se prepararon las siguientes Kromasil NH2 5 µm (250 x 10 mm) y la fase móvil era
soluciones tampón: acetato sódico 50 mM a pH 3.0 3.6 acetonitrilo:agua 68:32 (v/v). Los productos aislados se
4.0 4.4 y 5.0; y fosfato sódico 50 mM a pH 5.0 6.0 7.0 y enviaron a un laboratorio externo para los análisis de
8.0. La enzima se incubó durante 24 h a 35ºC en cada uno espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear
de los tampones y se midió la actividad residual con el (RMN).
método del DNS. Para el pH óptimo la actividad en
sacarosa 100 g/l (1 ml) se midió a 35ºC durante 20 min en 2.4. Entrecruzamiento de la enzima con transglutaminasa
los tampones descritos previamente. Posteriormente se (TG)
midió la actividad por el método del DNS. Para medir la
estabilidad frente a la temperatura la enzima se incubó Para el entrecruzamiento de LEV se añadieron
durante 1 h a diferentes temperaturas entre 4-75ºC y a pH diferentes cantidades de transglutaminasa (100 U/g) a una
5.0 y la actividad residual se midió por el método del solución de LEV y se incubaron durante 1 h a 35ºC con
DNS. Para determinar la temperatura optima se incubaron agitación suave. Los productos del entrecruzamiento se
reacciones de 1 ml con sacarosa 100 g/l a diferentes visualizaron electroforéticamente en condiciones nativas y
temperaturas (25-75ºC) y pH 5.0. La actividad de cada una desnaturalizantes. La presencia de actividad se determinó
de las reacciones se midió por el método del DNS. con el reactivo cloruro de 235-tripheniltetrazolio (TTC)
tras una incubación en sacarosa siguiendo el protocolo
2.3. Identificación y cuantificación de los productos de descrito por Mukasa et al. (27). Las reacciones se dejaron
reacción toda la noche a 4ºC para observar la precipitación de
conglomerados de alto peso molecular.
La identificación de los productos de la reacción de la
levansacarasa con sacarosa como sustrato se llevó a cabo
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