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Enzymatic synthesis of fructooligosaccharides that stimulate the gut microbiota
alto peso molecular cuando los eppendorfs con las 8A).
reacciones se dejaban por la noche en el frigorífico (Figura
Figura 7. Comparación de la síntesis de FOS por LEV soluble (triángulos) LEV inmovilizada (círculos negros) y LEV inmovilizada
previamente entrecruzada con TG (círculos blancos). A. 1-kestosa. B. 6-kestosa. C. Neokestosa. D. Nistosa.
3.4. Cambio de la estructura cuaternaria de LEV con el pH 3.5. Inmovilización
Según Goldman y cols. (22) la levansacarasa de Z.
La enzima LEV se inmovilizó siguiendo las dos
mobilis existe en dos formas dependiendo del pH. A estrategias descritas para aumentar su tamaño:
valores de pH por debajo de 5.0 forma microfibras que entrecruzamiento con TG y ajustando el pH por debajo de
aumentan su tamaño mientras que a pH por encima de 5.0 5.0. La enzima también se inmovilizó en su forma soluble
la enzima se encuentra principalmente en forma de dímero a pH 5.6 para comparar los resultados. Primero se
soluble. Para observar este efecto se incubó LEV en inmovilizaron por atrapamiento para formar esferas de
tampones a diferentes pH y se dejaron toda la noche. Se alginato (Figura 11E izq.). Aunque el rendimiento de la
observaron precipitados a pH 4.0 y en menor medida a pH inmovilización fue superior al 90% (Tabla 4) estas esferas
5.0 (Figura 8B) aunque en ambos casos significativamente demostraron no mostraron una gran estabilidad
menos que tras el entrecruzamiento con TG. También se operacional en batch; las tres estrategias perdían la enzima
incubó LEV sola en las mismas condiciones para comparar durante los primeros 4 ciclos de reacción (Figura
los resultados. 9A). Para intentar evitar el problema de la lixiviación las
esferas de alginato se secaron para formar DALGEEs
Figura 8. Precipitación de agregados de alto peso molecular. A. (Dry A LGinate Entrapped Enzymes) (Figura 11E dcha.).
Precipitación tras el entrecruzamiento con TG. 1: LEV 20 mg/ml. Esta estrategia resultó ser más eficaz. El tamaño de los
2 3 y 4: LEV 20 mg/ml tras 1 h de reacción con 1 5 y 10 U/ml de DALGEEs es aproximadamente un tercio de las bolas de
TG respectivamente. 5 6 y 7: LEV 20 mg/ml tras 2 h de reacción alginato (Figura 11). Los mejores resultados de actividad
con 10 20 y 40 U/ml de TG respectivamente. B. Precipitación de frente a lixiviación se obtuvieron con la estrategia de la
microfibras de LEV formadas a bajo pH. 1 2 y 3: LEV 20 mg/ml TG. Tras 15 ciclos de reacción el biocatalizador
en tampón acetato pH 4.0 5.0 y 6.0 respectivamente. 4 5 y 6: conservaba el 85% de su actividad inicial (Figura 9B) es
LEV 20 mg/ml en tampón fosfato pH 6.0 7.0 y 8.0 decir aproximadamente 18 U por gramo de biocatalizador.
respectivamente. El aumento de actividad tras el primer ciclo de reacción se
puede explicar por la hidratación de los DALGEEs al
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain entrar en contacto con el medio líquido de la reacción y
por lo tanto la ligera relajación de la red de alginato que
facilita el intercambio entre sustratos y productos. Los
DALGEEs a pH 4.0 tenían más actividad al principio pero
al estudiar la lixiviación con sacarosa 600 g/l a pH 4.0 la
sacarosa daba señal en el ensayo de DNS probablemente
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alto peso molecular cuando los eppendorfs con las 8A).
reacciones se dejaban por la noche en el frigorífico (Figura
Figura 7. Comparación de la síntesis de FOS por LEV soluble (triángulos) LEV inmovilizada (círculos negros) y LEV inmovilizada
previamente entrecruzada con TG (círculos blancos). A. 1-kestosa. B. 6-kestosa. C. Neokestosa. D. Nistosa.
3.4. Cambio de la estructura cuaternaria de LEV con el pH 3.5. Inmovilización
Según Goldman y cols. (22) la levansacarasa de Z.
La enzima LEV se inmovilizó siguiendo las dos
mobilis existe en dos formas dependiendo del pH. A estrategias descritas para aumentar su tamaño:
valores de pH por debajo de 5.0 forma microfibras que entrecruzamiento con TG y ajustando el pH por debajo de
aumentan su tamaño mientras que a pH por encima de 5.0 5.0. La enzima también se inmovilizó en su forma soluble
la enzima se encuentra principalmente en forma de dímero a pH 5.6 para comparar los resultados. Primero se
soluble. Para observar este efecto se incubó LEV en inmovilizaron por atrapamiento para formar esferas de
tampones a diferentes pH y se dejaron toda la noche. Se alginato (Figura 11E izq.). Aunque el rendimiento de la
observaron precipitados a pH 4.0 y en menor medida a pH inmovilización fue superior al 90% (Tabla 4) estas esferas
5.0 (Figura 8B) aunque en ambos casos significativamente demostraron no mostraron una gran estabilidad
menos que tras el entrecruzamiento con TG. También se operacional en batch; las tres estrategias perdían la enzima
incubó LEV sola en las mismas condiciones para comparar durante los primeros 4 ciclos de reacción (Figura
los resultados. 9A). Para intentar evitar el problema de la lixiviación las
esferas de alginato se secaron para formar DALGEEs
Figura 8. Precipitación de agregados de alto peso molecular. A. (Dry A LGinate Entrapped Enzymes) (Figura 11E dcha.).
Precipitación tras el entrecruzamiento con TG. 1: LEV 20 mg/ml. Esta estrategia resultó ser más eficaz. El tamaño de los
2 3 y 4: LEV 20 mg/ml tras 1 h de reacción con 1 5 y 10 U/ml de DALGEEs es aproximadamente un tercio de las bolas de
TG respectivamente. 5 6 y 7: LEV 20 mg/ml tras 2 h de reacción alginato (Figura 11). Los mejores resultados de actividad
con 10 20 y 40 U/ml de TG respectivamente. B. Precipitación de frente a lixiviación se obtuvieron con la estrategia de la
microfibras de LEV formadas a bajo pH. 1 2 y 3: LEV 20 mg/ml TG. Tras 15 ciclos de reacción el biocatalizador
en tampón acetato pH 4.0 5.0 y 6.0 respectivamente. 4 5 y 6: conservaba el 85% de su actividad inicial (Figura 9B) es
LEV 20 mg/ml en tampón fosfato pH 6.0 7.0 y 8.0 decir aproximadamente 18 U por gramo de biocatalizador.
respectivamente. El aumento de actividad tras el primer ciclo de reacción se
puede explicar por la hidratación de los DALGEEs al
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain entrar en contacto con el medio líquido de la reacción y
por lo tanto la ligera relajación de la red de alginato que
facilita el intercambio entre sustratos y productos. Los
DALGEEs a pH 4.0 tenían más actividad al principio pero
al estudiar la lixiviación con sacarosa 600 g/l a pH 4.0 la
sacarosa daba señal en el ensayo de DNS probablemente
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