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aunque en SOD2 si se formaban puentes disulfuro Mario Riera Romo
intracatenarios (41).
quimérica directamente en la sangre, con poco rechazo
La hidrólisis total con HCl fue empleada para el inmunológico. También se evaluó la actividad del
análisis de la composición aminoacídica de la SOD1 y la derivado, la cual no varió significativamente del control no
SOD2, donde además se empleó para la SOD1, el modificado, evidenciando que la conjugación no afecta los
tratamiento con dimetilsulfóxido y la oxidación con ácido residuos del centro activo ni la conformación nativa (43).
perfórmico, para identificar las cisteínas presentes en dicha
isoforma. La identificación de grupos sulfidrilos por La modificación con PEG o pegilación como
subunidad, fue realizada con p-cloromercurifenil sulfonato herramienta para mejorar las propiedades de las isoformas
y arrojó como resultado 1,2 grupos por subunidad, lo que de la SOD, ha sido también aplicada en la optimización de
se reducía a 0,3 grupos en la enzima autoxidada y una terapia experimental en modelos de rata para la
mantenida en una solución de fosfato de potasio a 0,05 M Isquemia Cerebral (44). La inyección intravenosa de
y EDTA, pH=7,8 por 2 semanas. Este resultado indica que 10,000 U/kg de PEG-SOD disminuye el volumen de
la autoxidación de la SOD1 disminuye su reactividad, en infarto a 139 +/- 9 mm3, respecto a un control tratado con
términos de grupos sulfidrilos accesibles a un modificador placebo, en el cual fue de 182 +/- 8 mm3, resultados que
químico (41). fueron determinados para un total de 38 individuos.
Por otra parte, han sido evaluados algunos factores que Estos resultados confirman el efecto protector y de
influyen sobre la catálisis de la SOD1 de eritrocitos estabilidad conferido al PEG, y constituyen más hallazgos
bovinos, tales como la oxidación (42). La inhibición de la que relacionan la SOD con enfermedades inflamatorias y
SOD1 por su producto, H2O2, fue examinada en términos lesiones tisulares.
de la oxidación de la histidina 118, ubicada en el centro
catalítico, lo que redujo significativamente la actividad. El Un enfoque interesante sobre la misma aplicación, es
residuo oxidado en forma de 2-oxo-histidina, pudo ser planteado por Fujita T. et al. en 1992 (45), donde exponen
detectado por hidrólisis ácida y análisis de la composición cómo es posible mejorar la estabilidad en plasma de la
aminoacídica de la SOD1 por RP-HPLC, que después se SOD humana recombinante (hSODr) y dirigir su acción a
identificó en la posición 118 por mapeo tríptico y análisis tejidos específicos, empleando la conjugación con
peptídico por RP-HPLC. El estudio de modificación polisacáridos y monosacáridos. Mediante la síntesis de
selectiva de histidina con H2O2, demostró la importancia cuatro derivados diferentes, hSOD-carboximetil dextrano,
de este residuo en el mecanismo catalítico de la enzima y hSOD-dietilaminoetil dextrano, hSOD galactosilada y
su implicación en la inactivación por producto. hSOD manosilada, evaluaron el tiempo de vida en plasma
y la distribución de los productos modificados por
Una de las mayores aplicaciones de la modificación farmacocinética en modelo de ratón, así como la actividad
química en la SOD, constituye el mejoramiento de la de los conjugados.
enzima para su uso terapéutico, que se propone extender el
tiempo de vida media en sangre, minimizar la inactivación Los derivados obtenidos retuvieron de un 50 a un 80 %
y mejorar la estabilidad en condiciones fisiológicas. de la actividad enzimática original y fueron estables en una
incubación con suero de ratón, manteniendo un 80 % de la
Sobre este tema tratan los trabajos de Veronese F. et al. actividad por 3 horas, lo que indica que la modificación no
en 1985 (43), que describen un método factible para la afecta la actividad y los conjugados no son neutralizados
obtención de conjugados de monometoxi-polietilen glicol por anticuerpos murinos. La administración por vía
con proteínas y péptidos, empleando derivados intravenosa de la hSODr nativa conllevó a una rápida
fenilcarbonados de polietilen glicol (PEG). Estos eliminación por vía renal, siendo detectada en alta
derivados altamente reactivos, pueden lograrse mediante concentración en la orina, mientras la hSOD-carboximetil
reacción con 2,4,5-tricloro-fenilcloroformiato o p- dextrano presentó un elevado tiempo de vida media en
nitrofenilcloroformiato. plasma, debido a la no filtración glomerular y a la
interacción con los tejidos. Las formas galactosilada y
Empleando dicho procedimiento, obtienen un derivado manosilada de la hSOD fueron incorporadas en poco
SOD1-PEG que posee mayor tiempo de retención en tiempo a las células parenquimatosas y no
sangre en ratas a las cuales les fue administrado por vía parenquimatosas del hígado, por endocitosis mediada por
endovenosa, respecto a la SOD1 nativa, la cual es aclarada receptor. La cinética de este aclaramiento hepático
rápidamente por los riñones y detectada en la orina de los presentó un comportamiento no lineal, disminuyendo con
animales. La conjugación con polímeros aumenta el radio incrementos en la dosis, con un valor máximo a la dosis
de la molécula, lo que disminuye su aclaramiento por mínima de 0.1 mg/kg (45).
filtración en el glomérulo renal y además preserva frente a
la acción de proteasas (43). Por otra parte, la hSOD-dietilaminoetil dextrano se
acumuló rápidamente en hígado, pero esta retención fue de
La enzima modificada es menos inmunogénica y es tipo electróstático y constituye un mecanismo de captación
reconocida con baja afinidad por anticuerpos específicos, menos específico (45).
debido a que el PEG modifica múltiples grupos amino en
la proteína, por lo que logra bloquear epítopos que afectan En conjunto, estos resultados validan la modificación
el reconocimiento. Esto puede constituir una ventaja si se con compuestos mono y polisacarídicos, no sólo en el
desea administrar enzimas no humanizadas o en forma mejoramiento de la estabilidad y el tiempo de vida media
en plasma de la hSODr, sino en su biodistribución. Esta
30 aplicación aporta ventajas claras para las terapias basadas
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
intracatenarios (41).
quimérica directamente en la sangre, con poco rechazo
La hidrólisis total con HCl fue empleada para el inmunológico. También se evaluó la actividad del
análisis de la composición aminoacídica de la SOD1 y la derivado, la cual no varió significativamente del control no
SOD2, donde además se empleó para la SOD1, el modificado, evidenciando que la conjugación no afecta los
tratamiento con dimetilsulfóxido y la oxidación con ácido residuos del centro activo ni la conformación nativa (43).
perfórmico, para identificar las cisteínas presentes en dicha
isoforma. La identificación de grupos sulfidrilos por La modificación con PEG o pegilación como
subunidad, fue realizada con p-cloromercurifenil sulfonato herramienta para mejorar las propiedades de las isoformas
y arrojó como resultado 1,2 grupos por subunidad, lo que de la SOD, ha sido también aplicada en la optimización de
se reducía a 0,3 grupos en la enzima autoxidada y una terapia experimental en modelos de rata para la
mantenida en una solución de fosfato de potasio a 0,05 M Isquemia Cerebral (44). La inyección intravenosa de
y EDTA, pH=7,8 por 2 semanas. Este resultado indica que 10,000 U/kg de PEG-SOD disminuye el volumen de
la autoxidación de la SOD1 disminuye su reactividad, en infarto a 139 +/- 9 mm3, respecto a un control tratado con
términos de grupos sulfidrilos accesibles a un modificador placebo, en el cual fue de 182 +/- 8 mm3, resultados que
químico (41). fueron determinados para un total de 38 individuos.
Por otra parte, han sido evaluados algunos factores que Estos resultados confirman el efecto protector y de
influyen sobre la catálisis de la SOD1 de eritrocitos estabilidad conferido al PEG, y constituyen más hallazgos
bovinos, tales como la oxidación (42). La inhibición de la que relacionan la SOD con enfermedades inflamatorias y
SOD1 por su producto, H2O2, fue examinada en términos lesiones tisulares.
de la oxidación de la histidina 118, ubicada en el centro
catalítico, lo que redujo significativamente la actividad. El Un enfoque interesante sobre la misma aplicación, es
residuo oxidado en forma de 2-oxo-histidina, pudo ser planteado por Fujita T. et al. en 1992 (45), donde exponen
detectado por hidrólisis ácida y análisis de la composición cómo es posible mejorar la estabilidad en plasma de la
aminoacídica de la SOD1 por RP-HPLC, que después se SOD humana recombinante (hSODr) y dirigir su acción a
identificó en la posición 118 por mapeo tríptico y análisis tejidos específicos, empleando la conjugación con
peptídico por RP-HPLC. El estudio de modificación polisacáridos y monosacáridos. Mediante la síntesis de
selectiva de histidina con H2O2, demostró la importancia cuatro derivados diferentes, hSOD-carboximetil dextrano,
de este residuo en el mecanismo catalítico de la enzima y hSOD-dietilaminoetil dextrano, hSOD galactosilada y
su implicación en la inactivación por producto. hSOD manosilada, evaluaron el tiempo de vida en plasma
y la distribución de los productos modificados por
Una de las mayores aplicaciones de la modificación farmacocinética en modelo de ratón, así como la actividad
química en la SOD, constituye el mejoramiento de la de los conjugados.
enzima para su uso terapéutico, que se propone extender el
tiempo de vida media en sangre, minimizar la inactivación Los derivados obtenidos retuvieron de un 50 a un 80 %
y mejorar la estabilidad en condiciones fisiológicas. de la actividad enzimática original y fueron estables en una
incubación con suero de ratón, manteniendo un 80 % de la
Sobre este tema tratan los trabajos de Veronese F. et al. actividad por 3 horas, lo que indica que la modificación no
en 1985 (43), que describen un método factible para la afecta la actividad y los conjugados no son neutralizados
obtención de conjugados de monometoxi-polietilen glicol por anticuerpos murinos. La administración por vía
con proteínas y péptidos, empleando derivados intravenosa de la hSODr nativa conllevó a una rápida
fenilcarbonados de polietilen glicol (PEG). Estos eliminación por vía renal, siendo detectada en alta
derivados altamente reactivos, pueden lograrse mediante concentración en la orina, mientras la hSOD-carboximetil
reacción con 2,4,5-tricloro-fenilcloroformiato o p- dextrano presentó un elevado tiempo de vida media en
nitrofenilcloroformiato. plasma, debido a la no filtración glomerular y a la
interacción con los tejidos. Las formas galactosilada y
Empleando dicho procedimiento, obtienen un derivado manosilada de la hSOD fueron incorporadas en poco
SOD1-PEG que posee mayor tiempo de retención en tiempo a las células parenquimatosas y no
sangre en ratas a las cuales les fue administrado por vía parenquimatosas del hígado, por endocitosis mediada por
endovenosa, respecto a la SOD1 nativa, la cual es aclarada receptor. La cinética de este aclaramiento hepático
rápidamente por los riñones y detectada en la orina de los presentó un comportamiento no lineal, disminuyendo con
animales. La conjugación con polímeros aumenta el radio incrementos en la dosis, con un valor máximo a la dosis
de la molécula, lo que disminuye su aclaramiento por mínima de 0.1 mg/kg (45).
filtración en el glomérulo renal y además preserva frente a
la acción de proteasas (43). Por otra parte, la hSOD-dietilaminoetil dextrano se
acumuló rápidamente en hígado, pero esta retención fue de
La enzima modificada es menos inmunogénica y es tipo electróstático y constituye un mecanismo de captación
reconocida con baja afinidad por anticuerpos específicos, menos específico (45).
debido a que el PEG modifica múltiples grupos amino en
la proteína, por lo que logra bloquear epítopos que afectan En conjunto, estos resultados validan la modificación
el reconocimiento. Esto puede constituir una ventaja si se con compuestos mono y polisacarídicos, no sólo en el
desea administrar enzimas no humanizadas o en forma mejoramiento de la estabilidad y el tiempo de vida media
en plasma de la hSODr, sino en su biodistribución. Esta
30 aplicación aporta ventajas claras para las terapias basadas
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
