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Superoxide Dismutase: a therapeutic candidate for oxidative stress
síntesis química, como la dansilalanina [ácido 2-amino-3 recientes correlacionan la expresión del mutante SOD1-
(5 (dimetilamino) naftaleno-1 sulfonamida) propanoico]. G93A en modelos murinos, con la activación de la quinasa
MST1 por especies reactivas del óxigeno, que se acumulan
Dicha técnica se empleó con éxito para marcar la debido la deficiencia de la actividad SOD1 provocada por
hSOD1 (37), para lo cual se transformaron por la agregación fibrilar (31). Los resultados obtenidos
mutagénesis dirigida, los codones para la glutamina 16 y el muestran una elevada actividad MST1 en motoneuronas en
triptófano 33 en codones de alanina, para luego incorporar cultivo y en modelos de ratón y rata, en los que se ha
en esas posiciones la dansilalanina y poder estudiar la inducido la expresión de la SOD1 mutante.
conformación del plegamiento y la orientación de dichos
residuos en el mismo. También permiten caracterizar el mecanismo de
inducción de la apotosis por MST1, el cual se identifica
Sin embargo la incorporación de un amino ácido no como una autofagia mitogénica que depende de la
natural a una proteína es un procedimiento complejo, que activación de la proteína p38, la vía de las MAP Quinasas
requirió en este caso, del empleo de un RNA de y las Caspasas (31).
transferencia y su Aminoacil-tRNA Sintetasa,
(tRNALeu5/LeuRS) provenientes de una cepa de E. coli, Por otra parte, lo planteado por Seijffers R. et al. en el
supresora de tRNA/ leucil-tRNA, para expresarlos en 2013 (40), sugiere que el factor de transcripción ATF3
levadura, donde constituyen proteínas ortogonales que no tiene un efecto neuroprotector y antiapoptótico en modelos
reaccionan con las Aminoacil-tRNA Sintetasas ni con los murinos para SOD1-G93A, lo que está mediado por
tRNA endógenos. Luego fue necesario generar una regeneración axónica y muscular, que contribuye a
biblioteca de mutantes para Leucil-tRNA Sintetasa, en minimizar los efectos de peroxidación y pérdida de
residuos del centro activo y del sitio editor, con el objetivo estructuras celulares, causados por la afectación en la
de modificar la especificidad de esta enzima por la leucina actividad SOD1. Estos estudios aportan conocimientos de
y lograr que incorporara la dansilalanina. vital importancia en el establecimiento de una terapia para
la ELA.
Una vez ingenierizado este sistema de incorporación,
los investigadores introdujeron la secuencia de la hSOD1 2.2. Modificaciones químicas
con cada mutación (Q16A y W33A) en la cadena SCY4 de
levadura, y pudieron obtener proteínas fluorescentes con Aunque los estudios de mutagénesis dirigida han tenido
un alto rendimiento. El estudio de desplegamiento y el protagonismo en los análisis de estructura-función de la
renaturalización las hSOD mutantes a diferentes hSOD, la modificación química de residuos ha contribuido
concentraciones de cloruro de guanidinio, permitió a la comprensión del funcionamiento de la enzima en
determinar que los residuos 16 y 33 se encuentran ocluidos determinadas condiciones fisiológicas, así como la
en el interior de la enzima nativa, interactuando con el evaluación de la influencia de las modificaciones naturales
núcleo de hoja β y que el triptófano 33 es altamente que ésta puede sufrir, sobre su funcionamiento.
afectado por algunos factores desnaturalizantes, como la
presencia de un agente caotrópico, por lo que constituye un Weisiger R. y Fridovich I. en 1973 (41), realizaron
residuo implicado en la estabilidad del monómero (37). varias modificaciones que contribuyeron a la
caracterización de las dos principales isoformas de la SOD
Otros aspectos de interés, como la capacidad de aislada de hígado de pollo, y muchos de sus hallazgos han
dimerización y el rol del triptófano 33 en este proceso, no sido demostrados para las isoformas de la hSOD. Estas
pudieron ser evaluados por el empleo del agente modificaciones comprenden el tratamiento con cianuro, β-
caotrópico, sin embargo sería relevante estudiar la mercaptoetanol, dimetilsulfóxido, p-cloromercurifenil
conformación del dímero empleando esta técnica de sulfonato, la hidrólisis ácida total con HCl a una
fluorescencia, pero en condiciones no desnaturalizantes. concentración de 6 M y la oxidación con ácido perfórmico.
Una segunda línea de investigación sobre mutagénesis El cianuro inhibe la trasferencia de electrones a nivel
dirigida aplicada a la SOD, se ha encaminado a obtener de los átomos de cobre del centro activo en la SOD1, pero
mutantes típicos que se relacionan con determinadas no tiene efecto sobre la SOD2 debido que el sitio activo
patologías, para evaluar en modelos animales de estas presenta manganeso. Este tratamiento químico permitió
enfermedades el papel de la SOD en la génesis y diferenciar las dos isoformas, citosólica y mitocondrial, de
agravamiento de las mismas. la SOD y confirmar la composición de cobre y manganeso
de cada enzima, que ya había sido encontrada en otras
En este sentido, son de gran importancia los resultados SOD de bacterias y de plantas. Por su parte, el β-
obtenidos por Gurney M. et al. en 1994 (38) y Banci L. et mercaptoetanol, un agente reductor fuerte, fue de gran
al. en 2008 (39), quienes demuestran la expresión de los utilidad en el estudio de las subunidades de la enzima,
mutantes de hSOD1, G93A y G94A, en la ELA. Estos junto con el detergente aniónico Dodecil Sulfato de Sodio
resultados confirman la presencia de agregados fibrilares y (SDS, por sus siglas en inglés), siendo este trabajo uno de
no funcionales de hSOD1, lo que evidencia la relación los primeros en plantear la estructura dimérica para SOD1
entre la introducción de glicina en las posiciones 93 y 94, y y la tetramérica para SOD2. También evidenció que la
la tendencia a la agregación, en la cual los puentes de dimerización de SOD1 y SOD2 no ocurría por puentes
hidrógeno juegan un papel decisivo. disulfuro, sólo en condiciones muy oxidantes del medio y
conllevaban a agregados multienzimáticos no activos,
Sobre esta temática, algunas investigaciones más
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain 29
síntesis química, como la dansilalanina [ácido 2-amino-3 recientes correlacionan la expresión del mutante SOD1-
(5 (dimetilamino) naftaleno-1 sulfonamida) propanoico]. G93A en modelos murinos, con la activación de la quinasa
MST1 por especies reactivas del óxigeno, que se acumulan
Dicha técnica se empleó con éxito para marcar la debido la deficiencia de la actividad SOD1 provocada por
hSOD1 (37), para lo cual se transformaron por la agregación fibrilar (31). Los resultados obtenidos
mutagénesis dirigida, los codones para la glutamina 16 y el muestran una elevada actividad MST1 en motoneuronas en
triptófano 33 en codones de alanina, para luego incorporar cultivo y en modelos de ratón y rata, en los que se ha
en esas posiciones la dansilalanina y poder estudiar la inducido la expresión de la SOD1 mutante.
conformación del plegamiento y la orientación de dichos
residuos en el mismo. También permiten caracterizar el mecanismo de
inducción de la apotosis por MST1, el cual se identifica
Sin embargo la incorporación de un amino ácido no como una autofagia mitogénica que depende de la
natural a una proteína es un procedimiento complejo, que activación de la proteína p38, la vía de las MAP Quinasas
requirió en este caso, del empleo de un RNA de y las Caspasas (31).
transferencia y su Aminoacil-tRNA Sintetasa,
(tRNALeu5/LeuRS) provenientes de una cepa de E. coli, Por otra parte, lo planteado por Seijffers R. et al. en el
supresora de tRNA/ leucil-tRNA, para expresarlos en 2013 (40), sugiere que el factor de transcripción ATF3
levadura, donde constituyen proteínas ortogonales que no tiene un efecto neuroprotector y antiapoptótico en modelos
reaccionan con las Aminoacil-tRNA Sintetasas ni con los murinos para SOD1-G93A, lo que está mediado por
tRNA endógenos. Luego fue necesario generar una regeneración axónica y muscular, que contribuye a
biblioteca de mutantes para Leucil-tRNA Sintetasa, en minimizar los efectos de peroxidación y pérdida de
residuos del centro activo y del sitio editor, con el objetivo estructuras celulares, causados por la afectación en la
de modificar la especificidad de esta enzima por la leucina actividad SOD1. Estos estudios aportan conocimientos de
y lograr que incorporara la dansilalanina. vital importancia en el establecimiento de una terapia para
la ELA.
Una vez ingenierizado este sistema de incorporación,
los investigadores introdujeron la secuencia de la hSOD1 2.2. Modificaciones químicas
con cada mutación (Q16A y W33A) en la cadena SCY4 de
levadura, y pudieron obtener proteínas fluorescentes con Aunque los estudios de mutagénesis dirigida han tenido
un alto rendimiento. El estudio de desplegamiento y el protagonismo en los análisis de estructura-función de la
renaturalización las hSOD mutantes a diferentes hSOD, la modificación química de residuos ha contribuido
concentraciones de cloruro de guanidinio, permitió a la comprensión del funcionamiento de la enzima en
determinar que los residuos 16 y 33 se encuentran ocluidos determinadas condiciones fisiológicas, así como la
en el interior de la enzima nativa, interactuando con el evaluación de la influencia de las modificaciones naturales
núcleo de hoja β y que el triptófano 33 es altamente que ésta puede sufrir, sobre su funcionamiento.
afectado por algunos factores desnaturalizantes, como la
presencia de un agente caotrópico, por lo que constituye un Weisiger R. y Fridovich I. en 1973 (41), realizaron
residuo implicado en la estabilidad del monómero (37). varias modificaciones que contribuyeron a la
caracterización de las dos principales isoformas de la SOD
Otros aspectos de interés, como la capacidad de aislada de hígado de pollo, y muchos de sus hallazgos han
dimerización y el rol del triptófano 33 en este proceso, no sido demostrados para las isoformas de la hSOD. Estas
pudieron ser evaluados por el empleo del agente modificaciones comprenden el tratamiento con cianuro, β-
caotrópico, sin embargo sería relevante estudiar la mercaptoetanol, dimetilsulfóxido, p-cloromercurifenil
conformación del dímero empleando esta técnica de sulfonato, la hidrólisis ácida total con HCl a una
fluorescencia, pero en condiciones no desnaturalizantes. concentración de 6 M y la oxidación con ácido perfórmico.
Una segunda línea de investigación sobre mutagénesis El cianuro inhibe la trasferencia de electrones a nivel
dirigida aplicada a la SOD, se ha encaminado a obtener de los átomos de cobre del centro activo en la SOD1, pero
mutantes típicos que se relacionan con determinadas no tiene efecto sobre la SOD2 debido que el sitio activo
patologías, para evaluar en modelos animales de estas presenta manganeso. Este tratamiento químico permitió
enfermedades el papel de la SOD en la génesis y diferenciar las dos isoformas, citosólica y mitocondrial, de
agravamiento de las mismas. la SOD y confirmar la composición de cobre y manganeso
de cada enzima, que ya había sido encontrada en otras
En este sentido, son de gran importancia los resultados SOD de bacterias y de plantas. Por su parte, el β-
obtenidos por Gurney M. et al. en 1994 (38) y Banci L. et mercaptoetanol, un agente reductor fuerte, fue de gran
al. en 2008 (39), quienes demuestran la expresión de los utilidad en el estudio de las subunidades de la enzima,
mutantes de hSOD1, G93A y G94A, en la ELA. Estos junto con el detergente aniónico Dodecil Sulfato de Sodio
resultados confirman la presencia de agregados fibrilares y (SDS, por sus siglas en inglés), siendo este trabajo uno de
no funcionales de hSOD1, lo que evidencia la relación los primeros en plantear la estructura dimérica para SOD1
entre la introducción de glicina en las posiciones 93 y 94, y y la tetramérica para SOD2. También evidenció que la
la tendencia a la agregación, en la cual los puentes de dimerización de SOD1 y SOD2 no ocurría por puentes
hidrógeno juegan un papel decisivo. disulfuro, sólo en condiciones muy oxidantes del medio y
conllevaban a agregados multienzimáticos no activos,
Sobre esta temática, algunas investigaciones más
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain 29
