review

Superoxide Dismutase: a therapeutic candidate for oxidative stress

Title in Spanish: Super—xido Dismutasa: un candidato terapŽutico para el estrŽs oxidativo

Mario Riera Romo1

1Facultad de Biolog’a, Universidad de la Habana, calle 25, entre I y J, # 455. CP. 10400, Vedado, Plaza de la Revoluci—n, La Habana, Cuba

*Corresponding Author: mayito265@gmail.com                An Real Acad Farm Vol. 81, N¼ 1 (2015), pp. 25-36

Received: February 13, 2015 Accepted: April 5, 2015           Language of Manuscript: Spanish

 



1. INTRODUCCIîN

La Super—xido Dismutasa humana (hSOD) es una metaloenzima que presenta tres isoformas: hSOD1, hSOD2 y hSOD3. La hSOD1 pertenece a la familia de las Super—xido Dismutasas Cu/Zn (1), contiene 155 amino‡cidos y actœa en forma de homod’mero (Figura 1) que se mantiene estabilizado por entrecruzamientos del tript—fano 33, residuo de dimerizaci—n (2). Posee dos ‡tomos de cobre en su centro activo, los cuales forman enlaces de coordinaci—n con las histidinas 47, 49, 64 y 121 de cada subunidad, funcionando como aceptores de electrones que le permiten a la enzima catalizar la dismutaci—n de los aniones super—xido producidos como resultado del metabolismo oxidativo celular (3) mediante la siguiente reacci—n: O2¥- + O2¥- + 2H+ → H2O2 + O2. Contiene tambiŽn iones zinc en su estructura, a nivel de las histidinas 72 y 81, y del asp‡rtico 84, los cuales aportan estabilidad estructural y favorecen la dimerizaci—n (4).

Se encuentra principalmente localizada en citoplasma y nœcleo donde protege al material genŽtico y a la mayor’a de los org‡nulos subcelulares, del estrŽs oxidativo (5). En estas localizaciones puede sufrir modificaciones postraduccionales que regulan su actividad y vida media, tales como la poliubiquitinaci—n, que media su degradaci—n proteos—mica, as’ como la dimerizaci—n por entrecruzamiento de tript—fano que impide la dimerizaci—n por puente disulfuro, la cual regula negativamente a la enzima. ƒsta tambiŽn puede ser palmitoilada, lo cual promueve la residencia en nœcleo pero disminuye la actividad, y succinilada en residuos adyacentes al centro catal’tico rico en cobre, lo que igualmente disminuye la actividad. La succinilaci—n es reversible y puede ser eliminada por la prote’na SIRT5 (6).

Entre las principales funciones en las que esta isoforma participa se encuentran la activaci—n de la v’a de se–alizaci—n de las MAP Quinasas, el trasporte ax—nico, la fragmentaci—n del DNA apopt—tico, la organizaci—n celular estereociliada de los receptores auditivos, la coagulaci—n sangu’nea, el envejecimiento celular, el metabolismo del hierro, la contracci—n del mœsculo card’aco, el procesamiento del glutati—n, la homeostasis neuronal y muscular, la respuesta celular a mœltiples drogas, la diferenciaci—n de los linfocitos T en el timo, el desarrollo folicular del ovario, el desarrollo embrionario y de la placenta, entre otras (7, 8).

 

Figura 1. Estructura d’mŽrica de la Super—xido Dismutasa 1 humana (hSOD1) obtenida mediante modelaci—n por comparaci—n. Se representa en verde la estructura en hoja β, en pœrpura los motivos en hŽlice α, en rojo los giros, en azul los lazos y en amarillo la superficie total del d’mero.

La hSOD2 pertenece a la familia de las Super—xido Dismutasas Fe/Mn y cataliza la misma reacci—n de dismutaci—n que la hSOD1 (9). Posee 244 amino‡cidos y actœa en forma de homotetr‡mero (Figura 2), que presenta un ‡tomo de manganeso por subunidad, el cual es responsable de la dismutaci—n y se encuentra coordinado en las histidinas 50, 98 y 187 y el asp‡rtico 183 (10). La enzima se localiza fundamentalmente en la matriz mitocondrial, asociada a la dismutaci—n inmediata de los aniones super—xido que all’ se producen, la protecci—n del propio organelo y el DNA mitocondrial contra la peroxidaci—n, y la regulaci—n de la apoptosis v’a mitocondria y citocromo C (11).

Figura 2. Estructura tetramŽrica de la Super—xido Dismutasa 2 humana (hSOD2) obtenida mediante modelaci—n por comparaci—n. Se representa en verde la estructura en hoja β, en pœrpura los motivos en hŽlice α, en cian las hŽlices ¹, en rojo los giros, en azul los lazos y en amarillo la superficie total del tetr‡mero.

Su expresi—n es inducida por la prote’na KRIT1 (12) y entre las principales modificaciones postraduccionales que experimenta, se encuentran, la nitraci—n de la tirosina 58, lo que regula negativamente la actividad (13), la acetilaci—n de las lisinas 68, 122 y 202, lo que disminuye la actividad enzim‡tica. Dicha modificaci—n puede ser revertida por la desacetilasa SIRT3 (11). Esta isoforma mitocondrial de la hSOD, est‡ involucrada en la respuesta a mœltiples drogas, la hematopoyesis, la diferenciaci—n celular, la homeostasia del O2, las v’as de se–alizaci—n de la apoptosis, el desarrollo del sistema renal, el mecanismo de la locomoci—n, la regulaci—n de la presi—n sangu’nea, entre otras mœltiples funciones (14).

La tercera isoforma, hSOD3, pertenece a la familia de las Dismutasas Cu/Zn, y posee 240 amino‡cidos (15). Actœa como homotetr‡mero (Figura 3), que contiene dos puentes disulfuro, entre la ciste’na 63 y la 208 y entre la 125 y la 207, un ion cobre por subunidad, coordinado en las histidinas 114, 116, 131 y 181, y un ion zinc a nivel de las histidinas 139 y 142, y del asp‡rtico 145 (16). La principal modificaci—n postraduccional de la enzima es la glicosilaci—n de la asparagina 107 y las lisinas 229 y 230 (17).

Las funciones en las que esta isoforma participa aœn no est‡n del todo claras, pero se sabe que es secretada al l’quido intersticial y se une con alta afinidad a heparina y hepar‡n sulfato, expuestos en los tejidos, por lo que debe estar involucrada en la protecci—n contra el estrŽs oxidativo en estas localizaciones.

Figura 3. Estructura tetramŽrica de la Super—xido Dismutasa 3 humana (hSOD3) obtenida mediante modelaci—n por comparaci—n. Se representa en verde la estructura en hoja β, en pœrpura los motivos en hŽlice α, en naranja las hŽlices 3-¹, en rojo los giros, en azul los lazos y en amarillo la superficie total del tetr‡mero.

1.1. Actividad SOD en la diabetes mellitus tipo I

Entre las causas no autoinmunes encontradas para la Diabetes Mellitus tipo I se ha propuesto el desbalance oxidativo y la peroxidaci—n causada por ERO, la cual provoca la destrucci—n de las cŽlulas β del p‡ncreas y la consecuente disminuci—n de los niveles de insulina, asociados a este trastorno metab—lico. Esta hip—tesis explica la patolog’a y algunas de sus principales complicaciones mediante un dŽficit en los mecanismos protectores contra el estrŽs oxidativo, tales como la actividad SOD (18).

La inactivaci—n por glucosa de la SOD1 extracelular, el desbalance de la relaci—n NADH/NAD+ (pseudohipoxia hiperglicŽmica) (19) y la desregulaci—n del metabolismo de los cofactores requeridos por la hSOD1, 2 y 3 (Cu2+, Zn2+ y Mn2+) parecen ser las principales causas (20, 21).

Experimentos en modelos murinos para la enfermedad han demostrado una disminuci—n de la actividad SOD en p‡ncreas, h’gado, ri–—n, cerebro, mœsculo y bazo (19), as’ como un decremento de la actividad SOD1 en eritrocitos y de la SOD2 en mitocondrias hep‡ticas de rata (20).

1.2. Papel de la SOD en el c‡ncer

La cŽlula tumoral en su proceso de transformaci—n maligna, inhibe y evade numerosos mecanismos de control, como la inducci—n de la apoptosis, el arresto de algunas fases del ciclo celular o el acortamiento de los tel—meros, mientras sobreexpresa molŽculas y activa mecanismos que le permiten la autosuficiencia para factores de crecimiento, la proliferaci—n descontrolada y la supervivencia celular, tales como el receptor del EGF, el factor de transcripci—n NF-κB o la propia enzima hSOD, que protege a la cŽlula cancer’gena de la peroxidaci—n causada por su propio metabolismo incrementado y no regulado (22).

Estudios realizados in vitro, en l’neas tumorales de fibroblastos de pulm—n humano, revelan incrementos en la actividad hSOD1 y 2 respecto a cŽlulas normales (23). Por otra parte, investigaciones en hepatomas y tumores asc’ticos de Ehrlich demostraron elevada actividad SOD2, comparando con tejido hep‡tico sano (24), al igual que las mediciones de la actividad SOD en la leucemia linfoc’tica, monoc’tica y mieloc’tica, las cuales corroboran niveles mayores de esta actividad enzim‡tica respecto a cŽlulas sangu’neas maduras sanas, del mismo tipo (25).

De forma contradictoria, estudios realizados en Adenocarcinoma Pancre‡tico encontraron una disminuci—n de los niveles de expresi—n y la actividad hSOD2, y asocian este hecho al papel mutagŽnico atribu’do a las ERO (26).

Algunos hallazgos m‡s recientes evidencian el incremento de la actividad hSOD1 en cŽlulas de c‡ncer de pulm—n humano y la relacionan con la prote’na pleiotr—pica COMMD1, demostrando que cŽlulas Ò knockdownÓ para esta prote’na exhiben mayores niveles de la actividad antioxidante (27).

1.3. SOD y los des—rdenes neurodegenerativos

Las llamadas Enfermedades o Trastornos Neurodegenerativos se caracterizan por apoptosis no regulada y muerte neuronal masiva en determinadas ‡reas del cerebro, por la influencia de mœltiples factores cuyo papel no est‡ del todo claro, lo que conduce a una pŽrdida de funciones neuromotoras y ps’quicas comprendidas dentro de un conjunto de patolog’as como la Enfermedad de Alzheimer (EA), el Parkinson (P), la Esclerosis Lateral Amiotr—fica (ELA), la Enfermedad de Huntington (EH) y otras. Dentro de estos factores causales se ha considerado la apoptosis por peroxidaci—n lip’dica y proteica y la apoptosis v’a citocromo C, como algunas de las m‡s probables, lo que implicar’a una afectaci—n en la actividad hSOD1 y 2 (28).

Estudios in vitro, en neuronas en cultivo, han demostrado que la inducci—n de la expresi—n de hSOD1 derivada de eritrocitos, impide o retarda la apoptosis causada por depleci—n del factor de crecimiento del nervio (NGF) (29), as’ como tambiŽn experimentos realizados con muestras de pacientes y en algunos modelos murinos, correlacionan bajos niveles de SOD2 con pŽrdida de neuronas y muerte de cŽlulas linfoblastoides, lo que provoca Ataxia Espinocerebelar tipo 3. La patolog’a se caracteriza por mutaciones en el gen ATXN3, que conllevan a la pŽrdida de afinidad por el factor de transcripci—n FOXO4, afect‡ndose el mecanismo de inducci—n de SOD2 ante estrŽs oxidativo (30).

Adicionalmente, se ha demostrado la relaci—n entre la SOD1 y la ELA en modelos murinos (31). La patolog’a se origina por apoptosis motoneuronal y se ha identificado como uno de los factores causales se ha debida a la activaci—n de la quinasa MST1 por ERO, lo que resulta en un incremento en la actividad de p38 y una inducci—n de autofagia mitogŽnica dependiente de quinasas en las neuronas motoras (31).

2. ESTUDIOS DE ESTRUCTURA-FUNCIîN DE LA SOD

Las variadas patolog’as en las que la enzima est‡ involucrada la convierten en objeto de estudio de numerosas investigaciones, con el objetivo de comprender las causas y complicaciones de algunas enfermedades multisistŽmicas asociadas al estrŽs oxidativo, as’ como mejorar racionalmente la estabilidad y actividad de la enzima con vistas a emplearla como producto terapŽutico recombinante, de administraci—n ex—gena. En el presente trabajo se realiza una revisi—n de las principales tŽcnicas de ingenier’a de prote’nas aplicadas al an‡lisis estructura-funci—n y a la optimizaci—n funcional de la SOD.

2.1. MutagŽnesis dirigida

Una de las l’neas de investigaci—n relacionada con experimentos de mutagŽnesis dirigida en la SOD, est‡ basada en la obtenci—n de mutantes para determinados residuos clave o la introducci—n de secuencias completas de otras variantes enzim‡ticas como la SOD extracelular (SOD3), para dilucidar elementos del mecanismo de acci—n de la enzima en condiciones fisiol—gicas.

Dentro de esta l’nea se encuentra el trabajo de Castellano I. et al. en 2009 (32), que expresa en E.coli, la SOD2 mitocondrial de rata, que posee un 93 % de identidad con la hSOD, y evalœa el comportamiento de cinco mutantes. En dos de ellos, Y34F-Q y Y34F-H, se reemplaz— la tirosina 34 por fenilalanina y s—lo difer’an en la posici—n 143, ocupada por glutamina e histidina, respectivamente. Otros dos mutantes, S82A-Q y S82A-H, conten’an alanina en la posici—n 82 en lugar de serina, e igualmente difer’an en la posici—n 143, con glutamina e histidina, respectivamente. El quinto mutante, H143, s—lo presentaba una histidina en lugar de la glutamina 143.

La variante salvaje, que contiene glutamina en la posici—n 143, y los mutantes, no presentaron diferencias en sus patrones electroforŽticos, sus perfiles cromatogr‡ficos en condiciones desnaturalizantes, ni en los an‡lisis realizados por espectrometr’a de masas.

Sin embargo, la actividad espec’fica fue mayor para la enzima nativa, mientras el mutante H143 tuvo la menor actividad, que represent— el 16 % de la determinada para la variante salvaje. Los mutantes simples Y34F-Q y S82A-Q retuvieron un 67 y un 81 % de la actividad y los dobles mutantes Y34F-H y S82A-H, presentaron un nivel de actividad espec’fica similar a H143. Estos resultados sugieren que este residuo de glutamina es importante para la cat‡lisis, al parecer para la fijaci—n o estabilizaci—n de algœn intermediario formado, pues no participa directamente en el mecanismo sino que influye en el microambiente del centro activo. Los residuos tirosina 34 y serina 82 no tienen un papel decisivo en este proceso.

TambiŽn fue evaluada la resistencia a la temperatura de todas las especies enzim‡ticas, obteniendo la curva de inactivaci—n y calculando el factor entr—pico y ent‡lpico de cada variante. En todos los casos la inactivaci—n sigui— una cinŽtica de primer orden, con una temperatura de inactivaci—n media de 80 0C, que no vari— significativamente para los mutantes (79 0C, 81 0C), lo que evidencia que dichas sustituciones no afectan la alta resistencia a la temperatura de la enzima nativa, aunque H143 present— el menor valor de factor ent‡lpico y la menor temperatura de inactivaci—n media que fue de 77 0C. De este experimento puede concluirse que la glutamina 143 tambiŽn influye en la alta resistencia de la enzima a la inactivaci—n por calor, al parecer por la estabilizaci—n de la conformaci—n. Una tirosina en esa posici—n aumenta ligeramente la inactivaci—n y una serina la disminuye, pues parece influir de forma positiva, en el establecimiento de una nueva conformaci—n resistente a la temperatura (32).

Igualmente se verific— la influencia de estos residuos en la fosforilaci—n de la enzima, principal mecanismo de regulaci—n de la misma. Por reacci—n con quinasas in vitro, se identific— la serina 82 como blanco de esta modificaci—n, pues no se detectan especies fosforiladas del mutante S82A-Q, s—lo de la enzima nativa. Esta modificaci—n de la serina 82 podr’a constituir un blanco de regulaci—n importante, debido al grado de conservaci—n que posee en otras SOD (32).

Otro aporte importante y reciente en este campo es realizado por Candas D. et al. en 2013 (33), quienes obtienen un mutante de la SOD2 denominado S106A, en el cual remplazan la serina 106 por alanina para evaluar el papel de dicho residuo en el reconocimiento por el complejo CyclinB1/Cdk1. Esta investigaci—n toma como antecedentes algunos estudios de caracterizaci—n de la Cdk1, donde se han identificado determinados residuos de serina que constituyen sitios de fosforilaci—n dentro de una secuencia consenso, en numerosas prote’nas citos—licas que Cdk1 reconoce a nivel de dicha secuencia, mediante la cual ejerce su regulaci—n por fosforilaci—n, implicacada en mœltiples procesos celulares (34, 35).

An‡lisis de estructura-funci—n del mutante S106A, muestran como principales resultados la reducci—n de la actividad SOD2 en cŽlulas murinas de mœsculo esquelŽtico y card’aco, extra’das de animales irradiados y transfectadas con S106A, respecto cŽlulas control de los propios animales sometidos al mismo tratamiento, pero que expresan la SOD2 nativa, en las cuales la actividad represent— el doble. TambiŽn logran correlacionar dicha disminuci—n con la inhibici—n de la fosforilaci—n, mediante ensayos de detecci—n de SOD2 fosforilada, por Western Blott, los cuales revelaron una disminuci—n de la especie fosforilada de la enzima en las cŽlulas transfectadas. Estos hallazgos en su conjunto, sugieren que la sustituci—n de la serina 106 por alanina en la SOD2 afecta el reconocimiento y la fosforilaci—n por Cdk1, lo que disminuye la actividad enzim‡tica, debido a que este residuo es requerido para la activaci—n por modificaci—n covalente de la SOD2 mediada por el complejo CyclinB1/Cdk1 (33).

Igualmente se han realizado investigaciones basadas en la obtenci—n de quimeras entre isoformas de la SOD (36), que han permitido evaluar su funci—n y dilucidar elementos estructurales de la SOD3 o SOD extracelular, entre los que se encuentran la demostraci—n de la forma tetramŽrica activa para la SOD3 y su afinidad por heparina y hepar‡n sulfato.

Estos investigadores logran expresar y purificar con un alto rendimiento, un mutante de la hSOD1 y la quimera hSOD1/3 (PseudoEC-SOD). El doble mutante monomŽrico de hSOD1, F50E/G51E, presenta una reducci—n de la actividad espec’fica en un 90 % respecto a la enzima nativa, lo que demuestra la importancia de la fenilalanina 50 y la glicina 51 para la actividad de la hSOD1, las cuales a diferencia de las histidinas, no est‡n directamente involucradas en el mecanismo catal’tico sino que se encuentran expuestas en la interfaz de contacto entre mon—meros de hSOD1.

Este experimento permite tambiŽn determinar que el d’mero est‡ estabilizado por fuerzas hidrof—bicas y de van der Waals, pues la introducci—n de ‡cido glut‡mico, que es polar y cargado, en la interfaz de dimerizaci—n (en el doble mutante) reduce la actividad espec’fica.

Dicho resultado se repite para la quimera triple mutante de PseudoEC-SOD, V24D/F50E/G51E, con la cual se confirma el papel de los residuos de fenilalanina y glicina en este caso para la heterodimerizaci—n, y adem‡s se comprueba que la sustituci—n de un amino‡cido apolar alif‡tico como la valina por uno polar con carga negativa como el ‡cido asp‡rtico, reduce dr‡sticamente la actividad catal’tica, pues afecta la heterodimerizaci—n requerida para la dismutaci—n de aniones super—xido (36).

TambiŽn se ha estudiado el plegamiento espec’fico del mon—mero de la enzima, el grado de exposici—n de ciertos residuos y c—mo influyen sobre los mismos diferentes factores, empleando una tŽcnica novedosa basada en la introducci—n de amino‡cidos fluorescentes obtenidos por s’ntesis qu’mica, como la dansilalanina [‡cido 2-amino-3 (5 (dimetilamino) naftaleno-1 sulfonamida) propanoico].

Dicha tŽcnica se emple— con Žxito para marcar la hSOD1 (37), para lo cual se transformaron por mutagŽnesis dirigida, los codones para la glutamina 16 y el tript—fano 33 en codones de alanina, para luego incorporar en esas posiciones la dansilalanina y poder estudiar la conformaci—n del plegamiento y la orientaci—n de dichos residuos en el mismo.

Sin embargo la incorporaci—n de un amino ‡cido no natural a una prote’na es un procedimiento complejo, que requiri— en este caso, del empleo de un RNA de transferencia y su Aminoacil-tRNA Sintetasa, (tRNALeu5/LeuRS) provenientes de una cepa de E. coli, supresora de tRNA/ leucil-tRNA, para expresarlos en levadura, donde constituyen prote’nas ortogonales que no reaccionan con las Aminoacil-tRNA Sintetasas ni con los tRNA end—genos. Luego fue necesario generar una biblioteca de mutantes para Leucil-tRNA Sintetasa, en residuos del centro activo y del sitio editor, con el objetivo de modificar la especificidad de esta enzima por la leucina y lograr que incorporara la dansilalanina.

Una vez ingenierizado este sistema de incorporaci—n, los investigadores introdujeron la secuencia de la hSOD1 con cada mutaci—n (Q16A y W33A) en la cadena SCY4 de levadura, y pudieron obtener prote’nas fluorescentes con un alto rendimiento. El estudio de desplegamiento y renaturalizaci—n las hSOD mutantes a diferentes concentraciones de cloruro de guanidinio, permiti— determinar que los residuos 16 y 33 se encuentran ocluidos en el interior de la enzima nativa, interactuando con el nœcleo de hoja β y que el tript—fano 33 es altamente afectado por algunos factores desnaturalizantes, como la presencia de un agente caotr—pico, por lo que constituye un residuo implicado en la estabilidad del mon—mero (37).

Otros aspectos de interŽs, como la capacidad de dimerizaci—n y el rol del tript—fano 33 en este proceso, no pudieron ser evaluados por el empleo del agente caotr—pico, sin embargo ser’a relevante estudiar la conformaci—n del d’mero empleando esta tŽcnica de fluorescencia, pero en condiciones no desnaturalizantes.

Una segunda l’nea de investigaci—n sobre mutagŽnesis dirigida aplicada a la SOD, se ha encaminado a obtener mutantes t’picos que se relacionan con determinadas patolog’as, para evaluar en modelos animales de estas enfermedades el papel de la SOD en la gŽnesis y agravamiento de las mismas.

En este sentido, son de gran importancia los resultados obtenidos por Gurney M. et al. en 1994 (38) y Banci L. et al. en 2008 (39), quienes demuestran la expresi—n de los mutantes de hSOD1, G93A y G94A, en la ELA. Estos resultados confirman la presencia de agregados fibrilares y no funcionales de hSOD1, lo que evidencia la relaci—n entre la introducci—n de glicina en las posiciones 93 y 94, y la tendencia a la agregaci—n, en la cual los puentes de hidr—geno juegan un papel decisivo.

Sobre esta tem‡tica, algunas investigaciones m‡s recientes correlacionan la expresi—n del mutante SOD1-G93A en modelos murinos, con la activaci—n de la quinasa MST1 por especies reactivas del —xigeno, que se acumulan debido la deficiencia de la actividad SOD1 provocada por la agregaci—n fibrilar (31). Los resultados obtenidos muestran una elevada actividad MST1 en motoneuronas en cultivo y en modelos de rat—n y rata, en los que se ha inducido la expresi—n de la SOD1 mutante.

TambiŽn permiten caracterizar el mecanismo de inducci—n de la apotosis por MST1, el cual se identifica como una autofagia mitogŽnica que depende de la activaci—n de la prote’na p38, la v’a de las MAP Quinasas y las Caspasas (31).

Por otra parte, lo planteado por Seijffers R. et al. en el 2013 (40), sugiere que el factor de transcripci—n ATF3 tiene un efecto neuroprotector y antiapopt—tico en modelos murinos para SOD1-G93A, lo que est‡ mediado por regeneraci—n ax—nica y muscular, que contribuye a minimizar los efectos de peroxidaci—n y pŽrdida de estructuras celulares, causados por la afectaci—n en la actividad SOD1. Estos estudios aportan conocimientos de vital importancia en el establecimiento de una terapia para la ELA.

2.2. Modificaciones qu’micas

Aunque los estudios de mutagŽnesis dirigida han tenido el protagonismo en los an‡lisis de estructura-funci—n de la hSOD, la modificaci—n qu’mica de residuos ha contribuido a la comprensi—n del funcionamiento de la enzima en determinadas condiciones fisiol—gicas, as’ como la evaluaci—n de la influencia de las modificaciones naturales que Žsta puede sufrir, sobre su funcionamiento.

Weisiger R. y Fridovich I. en 1973 (41), realizaron varias modificaciones que contribuyeron a la caracterizaci—n de las dos principales isoformas de la SOD aislada de h’gado de pollo, y muchos de sus hallazgos han sido demostrados para las isoformas de la hSOD. Estas modificaciones comprenden el tratamiento con cianuro, β-mercaptoetanol, dimetilsulf—xido, p-cloromercurifenil sulfonato, la hidr—lisis ‡cida total con HCl a una concentraci—n de 6 M y la oxidaci—n con ‡cido perf—rmico.

El cianuro inhibe la trasferencia de electrones a nivel de los ‡tomos de cobre del centro activo en la SOD1, pero no tiene efecto sobre la SOD2 debido que el sitio activo presenta manganeso. Este tratamiento qu’mico permiti— diferenciar las dos isoformas, citos—lica y mitocondrial, de la SOD y confirmar la composici—n de cobre y manganeso de cada enzima, que ya hab’a sido encontrada en otras SOD de bacterias y de plantas. Por su parte, el β-mercaptoetanol, un agente reductor fuerte, fue de gran utilidad en el estudio de las subunidades de la enzima, junto con el detergente ani—nico Dodecil Sulfato de Sodio (SDS, por sus siglas en inglŽs), siendo este trabajo uno de los primeros en plantear la estructura dimŽrica para SOD1 y la tetramŽrica para SOD2. TambiŽn evidenci— que la dimerizaci—n de SOD1 y SOD2 no ocurr’a por puentes disulfuro, s—lo en condiciones muy oxidantes del medio y conllevaban a agregados multienzim‡ticos no activos, aunque en SOD2 si se formaban puentes disulfuro intracatenarios (41).

La hidr—lisis total con HCl fue empleada para el an‡lisis de la composici—n aminoac’dica de la SOD1 y la SOD2, donde adem‡s se emple— para la SOD1, el tratamiento con dimetilsulf—xido y la oxidaci—n con ‡cido perf—rmico, para identificar las ciste’nas presentes en dicha isoforma. La identificaci—n de grupos sulfidrilos por subunidad, fue realizada con p-cloromercurifenil sulfonato y arroj— como resultado 1,2 grupos por subunidad, lo que se reduc’a a 0,3 grupos en la enzima autoxidada y mantenida en una soluci—n de fosfato de potasio a 0,05 M y EDTA, pH=7,8 por 2 semanas. Este resultado indica que la autoxidaci—n de la SOD1 disminuye su reactividad, en tŽrminos de grupos sulfidrilos accesibles a un modificador qu’mico (41).

Por otra parte, han sido evaluados algunos factores que influyen sobre la cat‡lisis de la SOD1 de eritrocitos bovinos, tales como la oxidaci—n (42). La inhibici—n de la SOD1 por su producto, H2O2, fue examinada en tŽrminos de la oxidaci—n de la histidina 118, ubicada en el centro catal’tico, lo que redujo significativamente la actividad. El residuo oxidado en forma de 2-oxo-histidina, pudo ser detectado por hidr—lisis ‡cida y an‡lisis de la composici—n aminoac’dica de la SOD1 por RP-HPLC, que despuŽs se identific— en la posici—n 118 por mapeo tr’ptico y an‡lisis pept’dico por RP-HPLC. El estudio de modificaci—n selectiva de histidina con H2O2, demostr— la importancia de este residuo en el mecanismo catal’tico de la enzima y su implicaci—n en la inactivaci—n por producto.

Una de las mayores aplicaciones de la modificaci—n qu’mica en la SOD, constituye el mejoramiento de la enzima para su uso terapŽutico, que se propone extender el tiempo de vida media en sangre, minimizar la inactivaci—n y mejorar la estabilidad en condiciones fisiol—gicas.

Sobre este tema tratan los trabajos de Veronese F. et al. en 1985 (43), que describen un mŽtodo factible para la obtenci—n de conjugados de monometoxi-polietilen glicol con prote’nas y pŽptidos, empleando derivados fenilcarbonados de polietilen glicol (PEG). Estos derivados altamente reactivos, pueden lograrse mediante reacci—n con 2,4,5-tricloro-fenilcloroformiato o p-nitrofenilcloroformiato.

Empleando dicho procedimiento, obtienen un derivado SOD1-PEG que posee mayor tiempo de retenci—n en sangre en ratas a las cuales les fue administrado por v’a endovenosa, respecto a la SOD1 nativa, la cual es aclarada r‡pidamente por los ri–ones y detectada en la orina de los animales. La conjugaci—n con pol’meros aumenta el radio de la molŽcula, lo que disminuye su aclaramiento por filtraci—n en el glomŽrulo renal y adem‡s preserva frente a la acci—n de proteasas (43).

La enzima modificada es menos inmunogŽnica y es reconocida con baja afinidad por anticuerpos espec’ficos, debido a que el PEG modifica mœltiples grupos amino en la prote’na, por lo que logra bloquear ep’topos que afectan el reconocimiento. Esto puede constituir una ventaja si se desea administrar enzimas no humanizadas o en forma quimŽrica directamente en la sangre, con poco rechazo inmunol—gico. TambiŽn se evalu— la actividad del derivado, la cual no vari— significativamente del control no modificado, evidenciando que la conjugaci—n no afecta los residuos del centro activo ni la conformaci—n nativa (43).

La modificaci—n con PEG o pegilaci—n como herramienta para mejorar las propiedades de las isoformas de la SOD, ha sido tambiŽn aplicada en la optimizaci—n de una terapia experimental en modelos de rata para la Isquemia Cerebral (44). La inyecci—n intravenosa de 10,000 U/kg de PEG-SOD disminuye el volumen de infarto a 139 +/- 9 mm3, respecto a un control tratado con placebo, en el cual fue de 182 +/- 8 mm3, resultados que fueron determinados para un total de 38 individuos.

Estos resultados confirman el efecto protector y de estabilidad conferido al PEG, y constituyen m‡s hallazgos que relacionan la SOD con enfermedades inflamatorias y lesiones tisulares.

Un enfoque interesante sobre la misma aplicaci—n, es planteado por Fujita T. et al. en 1992 (45), donde exponen c—mo es posible mejorar la estabilidad en plasma de la SOD humana recombinante (hSODr) y dirigir su acci—n a tejidos espec’ficos, empleando la conjugaci—n con polisac‡ridos y monosac‡ridos. Mediante la s’ntesis de cuatro derivados diferentes, hSOD-carboximetil dextrano, hSOD-dietilaminoetil dextrano, hSOD galactosilada y hSOD manosilada, evaluaron el tiempo de vida en plasma y la distribuci—n de los productos modificados por farmacocinŽtica en modelo de rat—n, as’ como la actividad de los conjugados.

Los derivados obtenidos retuvieron de un 50 a un 80 % de la actividad enzim‡tica original y fueron estables en una incubaci—n con suero de rat—n, manteniendo un 80 % de la actividad por 3 horas, lo que indica que la modificaci—n no afecta la actividad y los conjugados no son neutralizados por anticuerpos murinos. La administraci—n por v’a intravenosa de la hSODr nativa conllev— a una r‡pida eliminaci—n por v’a renal, siendo detectada en alta concentraci—n en la orina, mientras la hSOD-carboximetil dextrano present— un elevado tiempo de vida media en plasma, debido a la no filtraci—n glomerular y a la interacci—n con los tejidos. Las formas galactosilada y manosilada de la hSOD fueron incorporadas en poco tiempo a las cŽlulas parenquimatosas y no parenquimatosas del h’gado, por endocitosis mediada por receptor. La cinŽtica de este aclaramiento hep‡tico present— un comportamiento no lineal, disminuyendo con incrementos en la dosis, con un valor m‡ximo a la dosis m’nima de 0.1 mg/kg (45).

Por otra parte, la hSOD-dietilaminoetil dextrano se acumul— r‡pidamente en h’gado, pero esta retenci—n fue de tipo electr—st‡tico y constituye un mecanismo de captaci—n menos espec’fico (45).

En conjunto, estos resultados validan la modificaci—n con compuestos mono y polisacar’dicos, no s—lo en el mejoramiento de la estabilidad y el tiempo de vida media en plasma de la hSODr, sino en su biodistribuci—n. Esta aplicaci—n aporta ventajas claras para las terapias basadas en la administraci—n ex—gena de hSOD, la cual requiere la acci—n selectiva de la enzima en las lesiones tisulares y zonas localizadas de inflamaci—n.

En este campo tambiŽn se ha probado la modificaci—n de la SOD con otros pol’meros, como el copol’mero de Žter divinilo y anh’drido maleico (DIVEMA, por sus siglas en inglŽs), lo que produce conjugados con buena retenci—n de la actividad, que mostraron mayor tiempo de vida media y una captaci—n incrementada en el h’gado, en modelo de rata para edema pulmonar con reperfusi—n bronquial. Dichos conjugados fueron capaces de reducir los procesos inflamatorios intrahep‡ticos, proteger contra el edema bronquial y evitar la infiltraci—n leucocitaria en los vasos sangu’neos, lo que fue evaluado por microscop’a electr—nica (46).

De igual forma la conjugaci—n de la SOD con la sal s—dica del ‡cido hialur—nico se ha logrado con Žxito, empleando la modificaci—n por enlaces amida entre los grupos amino de la prote’na y los grupos carboxilo del ‡cido hialur—nico, con el uso de la 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimida. (47). Los derivados resultantes retuvieron un 70 % de la actividad enzim‡tica original y manifestaron un elevado efecto antiinflamatorio y no inmunogŽnico, en modelo de rata para edema de la pata inducido por la carragenina y para artritis adyuvante.

Otras estrategias, basadas en la conjugaci—n de la hSOD1 a prote’nas sŽricas por modificaci—n de residuos, tambiŽn han ofrecido buenos resultados, en tŽrminos del aumento del radio de la enzima y por tanto la reducci—n del aclaramiento renal y la eliminaci—n en la orina (48). El conjugado entre la hSOD1 y la albœmina sŽrica se forma espont‡neamente en sangre al suminstrar la hSOD1 modificada en sus residuos de lisina con AMS [poli-(‡cido malŽico-co-estireno) butil Žster].

La modificaci—n qu’mica fue evaluada in vitro, por cromatograf’a de afinidad con una matriz de albœmina-sefarosa, que demostr— retenci—n espec’fica de la AMS-hSOD1, mientras la hSOD1 nativa fue elu’da en la fracci—n no fijada. La evaluaci—n in vivo en modelos animales, revel— un incremento en el tiempo de vida media en plasma de la AMS-hSOD1, que fue de 6 horas, respecto a la enzima no modificada que fue eliminada por la orina en menos de 4 minutos. Adicionalmente, la medici—n de radicales libres plasma evidenci— una disminuci—n, respecto a los animales tratados con la hSOD1 nativa, lo que valida este producto modificado para la reducci—n de radicales libres circulantes (48).

Algunas investigaciones m‡s recientes, demuestran la eficacia de la modificaci—n de la SOD con polisac‡ridos i—nicos tales como la carboximetil quitina, el manano (49) y la carboximetil celulosa (CMC) (50), siendo esta œltima modificaci—n factible de realizar, por alquilaci—n reductiva con el derivado polialdeh’dico de la CMC o con la carbodiimida como agente acoplante. Estos derivados polisacar’dicos de SOD retuvieron una actividad mayor del 50 % y presentaron —ptimos resultados farmacocinŽticos en modelos de rat—n y rata.

2.3. Inmovilizaci—n covalente

Debido a que la SOD cataliza una reacci—n muy espec’fica, en la que el ani—n super—xido no puede ser remplazado por un sustrato sintŽtico con vistas a obtener un producto para uso industrial o de interŽs biomŽdico, no ha existido un desarrollo marcado en el ‡rea de la biocat‡lisis y los bioprocesos, vinculado a esta enzima. M‡s bien la alta especificidad de la prote’na y la generaci—n de un producto (H2O2), detectable y cuantificable por tŽcnicas espectrofotomŽtricas, quimioluminiscentes y otras, ha propiciado que la principal aplicaci—n de la inmovilizaci—n covalente de esta enzima, haya sido la obtenci—n de biosensores para medir el estrŽs oxidativo y los radicales libres en sistemas biol—gicos.

Debido a esto, las principales propuestas de inmovilizaci—n de la SOD para aplicaciones concretas, han estado basadas en la fijaci—n covalente, mediante reactivos bifuncionales tales como el glutaraldeh’do, a micropel’culas formadas por ‡cidos org‡nicos, polisac‡ridos, pol’meros industriales u org‡nicos, recubriendo superficies met‡licas de electrodos de oro o platino, as’ como nanopart’culas con diversas propiedades que constituyen la base de estos biosensores (Figura 4).

Figura 4. Principales configuraciones de inmovilizaci—n covalente, que se han empleado en el trabajo con la SOD. A) Sobre nanopart’culas de oro recubiertas de polisac‡ridos o ‡cidos org‡nicos. B) Sobre nanopart’culas de —xidos met‡licos modificadas con pol’meros org‡nicos. C) Sobre micropel’culas polimŽricas que recubren electrodos met‡licos.

En 2001, Ge B. et al. (51), desarrollan un biosensor, inmovilizando la SOD1 de eritocitos bovinos en un electrodo de oro modificado con ‡cido 3-mercaptopropi—nico (AMP) a partir de la 2-mercaptoetilamina (MEA) fijada al electrodo con un tratamiento extremo a base de ‡cido sulfœrico. El oro modificado puede incorporar la enzima, por reacci—n con 1-Etil-3(3-dimetil aminopropil) carbodiimida (EDC). Se obtuvo una repuesta electroqu’mica pronunciada y sostenida por parte de la SOD1 inmovilizada, con un potencial de 56 +/- 9 mV, en tamp—n de baja fuerza i—nica y libre de prote’nas, a pH 7,5. Este resultado indica una transformaci—n redox cuasirreversible, por parte de la enzima sobre la superficie de oro.

Aunque se constat— cierta pŽrdida de actividad por parte de la prote’na, se mantiene la sensibilidad necesaria para la funci—n del biosensor. El empleo de un modificador de mayor longitud podr’a solucionar esta deficiencia, al permitir una mayor interacci—n prote’na-electrodo (51).

Un acercamiento similar a esta aplicaci—n es descrito por Endo K. et al. en 2002 (52), con la obtenci—n de un biosensor a partir de SOD2 inmovilizada en un electrodo de platino con el empleo de glutaraldeh’do y un mediador para el transporte de electrones, compuesto por ferrocen-carboxaldeh’do, cianamida y albœmina bovina. El sistema completo fue recubierto con poliuretano como protecci—n adicional.

Este biosensor se emple— para cuantificar aniones super—xido en soluci—n, generados por la Xantina Oxidasa en presencia de xantina, mediante una corriente elŽctrica, acoplando el electrodo a un sistema de detecci—n. En las soluciones evaluadas la se–al del sensor creci— linealmente, de forma proporcional a las cantidades de xantina a–adida, lo que evidencia la precisi—n de las mediciones. TambiŽn se determin— la capacidad de detecci—n del sensor a partir de tejido card’aco de ratas inyectadas con endotoxina, resultando en una medici—n estable con valores elevados, en concordancia con la situaci—n de estrŽs oxidativo generada (52).

En otras investigaciones se ha combinado la mutagŽnesis dirigida y la inmovilizaci—n, para lograr mŽtodos factibles y eficientes de fijaci—n covalente de la SOD1 a superficies de oro, con aplicaci—n en la construcci—n de biosensores (53). En este trabajo se obtienen 6 mutantes monomŽricos en los que se han introducido una o dos ciste’nas adicionales, lo que permite inmovilizar la enzima mediante grupos sulfidrilos en una superficie de oro, sin necesidad de recubrimiento org‡nico ni otros modificadores. Un biosensor obtenido por este principio fue evaluado en la determinaci—n de radicales super—xido, mostrando una mayor sensibilidad que los electrodos de Citocromo C cl‡sicos (53), sin interferencias, pero sin alcanzar la sensibilidad del sensor de oro modificado con AMP a partir del d’mero de SOD1 inmovilizado.

La otra aplicaci—n fundamental, de car‡cter m‡s reciente en el campo de la inmovilizaci—n de la SOD, es la fijaci—n a nanopart’culas met‡licas (Figura 4, A y B).

En este sentido destaca el trabajo de Villalonga R. et al. en 2005 (54), con la obtenci—n de nanopart’culas de oro pertioladas y recubiertas de β-ciclodextrina, que permiten la inmovilizaci—n supramolecular de la SOD1 con alta retenci—n de la actividad. Este dispositivo tiene potencialidades para ser empleado en futuras terapias contra el estrŽs oxidativo.

TambiŽn se han obtenido biosensores para radicales a partir de la SOD inmovilizada en nanopart’culas de —xido de n’quel, que a su vez se retienen por electrodeposici—n con voltametr’a c’clica en un electrodo de fibra de carbono modificado (55). El sensor obtenido por este mŽtodo, mantiene un proceso redox bien definido con un potencial de −0,03 V en pH 7,4. La SOD inmovilizada present— un recubrimiento superficial (I) y una constante de transferencia electr—nica heterogŽnea (ks) de 1,75 × 10−11 mol/ cm2 y 7,5 ± 0,5 s−1, respectivamente. En general, el biosensor exhibi— una respuesta amperomŽtrica muy r‡pida (3 s) en un rango de concentraciones de ani—n super—xido de 10 μM a 0,25 mM, una alta sensibilidad (12,40 nA μM−1 cm−2) y un l’mite de detecci—n de 2,66 μM. Este dispositivo muestra elevada estabilidad, reproducibilidad y tiempo de vida (54), lo que valida las nanopart’culas de —xidos met‡licos como portadores eficientes de SOD inmovilizada, para determinaciones amperomŽtricas de radicales sin interferencias.

Otra aplicaci—n importante de la SOD en el campo de la nanotecnolog’a, fue aportada por Song C. et al. en 2012 (55), que inmovilizan por medio de glutaraldeh’do, la SOD2 termoestable aislada del organismo Thermus thermophilus, en nanopart’culas supermagnŽticas de —xido de hierro y silicio modificadas con pol’meros org‡nicos.

Las part’culas con la enzima incorporada fueron caracterizadas por difracci—n de rayos X, microscop’a electr—nica de transmisi—n y an‡lisis magnetomŽtrico. Se registr— un di‡metro de 40 ± 5 nm y un valor de saturaci—n de magnetizaci—n de 27,9 emu/g, sin remanencia o coersitividad. En comparaci—n con la enzima libre, la SOD2 inmovilizada present— mayor resistencia a la temperatura, pH, iones met‡licos, inhibidores enzim‡ticos y detergentes (55). Otros resultados mostraron que la enzima puede ser reutilizada 10 veces sin pŽrdida significativa en la actividad, lo que evidencia la factibilidad de este mŽtodo de inmovilizaci—n y la estabilidad que brinda el anclaje qu’mico a nanopart’culas (55). Estos nanodispositivos ofrecen ventajas en la biomedicina y otras aplicaciones industriales basadas en la SOD2.

2.4. Atrapamiento y microencapsulaci—n

La encapsulaci—n en estructuras polimŽricas y liposomas, as’ como el atrapamiento en geles y pol’meros proteicos (Figura 5), tambiŽn han encontrado su aplicaci—n en el trabajo con la SOD, siendo empleados tanto para la obtenci—n de biosensores como para el mejoramiento terapŽutico y la liberaci—n controlada de la enzima.

En algunos experimentos se ha realizado el atrapamiento de SOD y Xantina Oxidasa en matrices de gelatina entrecruzada con glutaraldeh’do (56), creando sistemas estables de porosidad controlada (Figura 5A) que permiten la difusi—n de sustratos y constituyen modelos para la generaci—n y evaluaci—n de radicales libres.

Campanella L. et al. en 1999 (57) obtuvieron un biosensor a partir de la SOD atrapada en geles de κ-carrageno sobre electrodos indicadores, probando con electrodos de Clark y con electrodos amperomŽtricos cl‡sicos para H2O2, resultando estos œltimos, m‡s efectivos. El biosensor fue evaluado in vitro con el sistema xantina/Xantina Oxidasa y permiti— la caracterizaci—n de otras prote’nas antioxidantes en cuanto a su efecto sobre el ani—n super—xido.

Figura 5. Representaci—n esquem‡tica de cuatro formas de inmovilizaci—n mediada por atrapamiento que se han empleado en la caracterizaci—n y optimizaci—n de la SOD. A) Atrapamiento en una red proteica entrecruzada con glutaraldeh’do. B) Atrapamiento en gel. C) Microencapsulaci—n en cristal de s’lica porosa. D) Encapsulaci—n en liposomas.

Un acercamiento m‡s actual a esta aplicaci—n es descrito por Emregul E. en 2005 (58), quien logra un biosensor para aniones radicales, atrapando la SOD en gelatina reforzada por entrecruzamiento con glutaraldeh’do sobre la superficie de un electrodo de platino. El sensor fue evaluado en varias condiciones de pH y fuerza i—nica, manteniendo una medici—n estable, proporcional a la concentraci—n de O2-, con un l’mite de detecci—n de 0,01 mmol L−1 y una relaci—n se–al/ruido de 3. El dispositivo retuvo de un 80 a un 60 % de su sensibilidad tras el uso por 4 semanas, demostrando que la gelatina brinda un microambiente estable y biocompatible con la SOD, que mantiene la actividad enzim‡tica de forma eficiente (58). Algunas aplicaciones directas en las que este biosensor pudo ser probado, fueron la evaluaci—n de la capacidad antioxidante de drogas derivadas de ‡cido acetilsalic’lico y la determinaci—n del estrŽs oxidativo en tejido cerebral tumoral y sano (58).

La microencapsulaci—n ofrece tambiŽn ventajas atractivas para el estudio de la SOD en microambientes controlados y para posibles aplicaciones terapŽuticas. Un ejemplo lo constituye el atrapamiento de la SOD1 en microc‡psulas de cristal de s’lica porosa (Figura 5C), obtenido por el mŽtodo sol-gel (59). Estas microc‡psulas se logran con condiciones poco dr‡sticas, lo que permite el mantenimiento de una elevada actividad enzim‡tica en su interior. Adem‡s son porosas lo que permite el intercambio de sustancias pero impide la pŽrdida de la enzima, y son transparentes, lo que facilita el seguimiento de las propiedades —pticas de las prote’nas encapsuladas.

Por otra parte la encapsulaci—n de la SOD en liposomas (Figura 5D) ha logrado mejorar la biodistribuci—n y preservar la estabilidad, siendo efectiva como estrategia terapŽutica. La SOD1 recombinante encapsulada en liposomas fue utilizada en el tratamiento de heridas por quemaduras (60), demostrando una reducci—n de las lesiones tisulares, el edema y la necrosis local, as’ como un incremento en la reepitelializaci—n y la cicatrizaci—n en pacientes tratados, respecto a pacientes control que recibieron placebo.

Igualmente se ha constatado la efectividad de liposomas recubiertos de PEG como sistemas portadores de SOD1, que permiten su liberaci—n controlada en sitios artr’ticos inflamados, en pacientes y modelos murinos de artritis reumatoide, mediando una disminuci—n de la inflamaci—n y del dep—sito de inmunocomplejos (61).

Otra aplicaci—n referida a la encapsulaci—n de la SOD en liposomas, es descrita por Pluta J. y Karolewicz B. en 2003 (62), que encapsulan la enzima en liposomas obtenidos a partir de lecitina de soya, estearilamina, fosfatidilglicerol y colesterol, recubiertos de quitosano, un polisac‡rido biocompatible de uso industrial y biomŽdico. Este recubrimiento funciona como mucoadhesivo por su alta hidrataci—n, permitiendo al liposoma depositarse y liberar su contenido en las mucosas (62). Estos preparados han mostrado alta retenci—n de la actividad SOD y ofrecen propiedades œtiles, desde el punto de vista terapŽutico para el tratamiento de inflamaci—n y lesiones mucosales, as’ como para algunas hipersensibilidades que ocurren a nivel de las mucosas (62).

Una aplicaci—n similar es lograda por Dom’nguez A. et al. en el 2004 (63), quienes logran un sistema de liberaci—n controlada de la SOD, atrap‡ndola en hidrogeles de CMC. ƒste constituye uno de los primeros intentos de inmovilizaci—n por atrapamiento de la SOD en hidrogeles, para uso biomŽdico. Dicho sistema se logr— por adici—n estequiomŽtrica de 2-cloro-1-metilpiridin ioduro (CMP-I) a la soluci—n de la enzima con CMC. El preparado retuvo la actividad enzim‡tica de forma eficiente y mejor— las propiedades farmacol—gicas respecto a la enzima nativa (63). La cinŽtica de liberaci—n fue determinada, presentando una liberaci—n de un 50 % a las 72 horas. Este sistema basado en hidrogeles de entrecruzamiento intermedio (54 %), promueve adem‡s la proliferaci—n de fibroblastos humanos en cultivo, pues su estructura porosa y esponjosa provee un ambiente adecuado que actœa como soporte para las cŽlulas adherentes, que no es muy reticulado o compacto, lo que permite el crecimiento (63).

Los resultados expuestos reafirman los sistemas de liberaci—n controlada de SOD basados en hidrogeles, como herramientas œtiles en la farmacolog’a y la terapia, que disminuyen el estrŽs oxidativo y promueven la proliferaci—n de fibroblastos y la reparaci—n tisular.

3. PERSPECTIVAS TERAPƒUTICAS

Como se ha abordado en esta revisi—n, las principales tŽcnicas de ingenier’a de prote’nas encaminadas al trabajo con las isoformas de la SOD, han permitido su caracterizaci—n, el an‡lisis estructura-funci—n y el desarrollo de algunas aplicaciones terapŽuticas para afecciones relacionadas al estrŽs oxidativo. Se han evaluado las tres isoformas de esta prote’na y se ha establecido, tanto su funci—n biol—gica, como su implicaci—n en determinadas patolog’as, por lo que las perspectivas de investigaci—n actuales relacionadas con la SOD, est‡n dirigidas al mejoramiento de la enzima para implementar terapias basadas en la administraci—n ex—gena.

Las principales deficiencias de estas estrategias terapŽuticas, radican en la baja estabilidad de la enzima, la imposibilidad de dirigirla a un blanco espec’fico, la susceptibilidad a la inactivaci—n y la prote—lisis, y la r‡pida excreci—n por v’a renal, que limita el tiempo de vida media en sangre. Algunas de las tŽcnicas de modificaci—n con polisac‡ridos, PEG y otros pol’meros org‡nicos, as’ como la microencapsulaci—n y el atrapamiento, parecen resolver algunos de estos inconvenientes y en general elevan la permanencia en plasma y protegen contra la inactivaci—n, la prote—lisis y la neutralizaci—n por anticuerpos. Sin embargo la terapia basada en administraci—n de SOD aœn afronta retos, como el mejoramiento de la biodistribuci—n y un mayor tiempo de vida media, que permita minimizar las dosis y emplear esta enzima como adyuvante para mœltiples terapias combinadas, o como producto de uso t—pico y sistŽmico, para variados trastornos isquŽmicos, vasculares, neurodegenerativos, autoinmunes e incluso el c‡ncer.

La combinaci—n de sistemas de liberaci—n controlada y modificaci—n con sustancias biocompatibles, junto con las tecnolog’as de acoplamiento de anticuerpos o nanopart’culas, ofrecen opciones atractivas y promisorias en cuanto a la ingenierizaci—n de esta prote’na y la bœsqueda de un producto antioxidante eficiente para uso cl’nico.

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