Enzymatic synthesis of fructooligosaccharides that stimulate the gut microbiota

Title in Spanish: Síntesis enzimática de fructooligosacáridos estimuladores de la microbiología colónica

Paloma Santos-Moriano^1* Lucía Fernández-Arrojo¹ Bárbara Rodríguez-Colinas¹ Antonio Ballesteros¹ Francisco J. Plou¹

¹Instituto de Catálisis y Petroleoquímica CSIC 28049 Madrid Spain

^*Corresponding Author: paloma.santos@csic.es     An Real Acad Farm Vol. 81 Nº 1 (2015) pp. 48-62

Received:  February 3 2015  Accepted: February 27 2015      Language of Manuscript: Spanish

 

1. INTRODUCCIÓN

La microflora o microbiota intestinal se define como un complejo ecosistema dinámico de especies microbianas residentes en el intestino humano el cual es colonizado por un gran número de bacterias. Como puede observarse en la Figura 1 estos microorganismos van aumentando su concentración desde la boca hasta el recto siendo máxima en el colon con aproximadamente 10¹² UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por gramo de contenido intestinal. El colon está habitado por unas cuatrocientas especies bacterianas (1) y se divide en colon ascendente o proximal colon transversal colon descendente o distal y colon sigmoidal. Las bacterias presentes tienen actividades fluctuantes en función de la disponibilidad de sustrato pH potencial redox y distribución en el colon (2). Así los microorganismos residentes en el colon proximal tienen un suministro abundante de nutrientes provenientes de la dieta de modo que crecen muy rápido causando una disminución del pH. Sin embargo en el colon distal la disponibilidad de sustrato es menor las bacterias crecen más lentamente y el pH se acerca a la neutralidad (3).

Las funciones metabólicas de la microbiota intestinal consisten en la fermentación de sustratos dietéticos no digeribles. En concreto la fermentación de los hidratos de carbono es una importante fuente de energía para la proliferación bacteriana en el colon y produce ácidos grasos de cadena corta (AGCC). Mediante esta acidificación se favorece la absorción de minerales como Fe Mg y Ca. La actividad metabólica también incluye la producción de algunas vitaminas tales como vitamina K B12 biotina ácido fólico ácido pantoténico y la síntesis de aminoácidos a partir de amoniaco o de urea (6).  Son muchos los factores que pueden influir sobre los niveles de estas poblaciones microbianas alterando el equilibrio bacteriano de la flora intestinal tales como la dieta el estrés malos hábitos administración de antibióticos etc(7). Recientemente en un estudio llevado a cabo con 22 individuos clasificaron 3 enterotipos humanos caracterizados por su microbiota intestinal: enterotipo 1 donde predominan Bacteroides; enterotipo 2 dominando la especie Prevotella; y enterotipo 3 con mayor proporción de Ruminococcus. Estos enterotipos parecen venir determinados fundamentalmente por la dieta a largo plazo (8). Lo fundamental es mantener un equilibrio entre las distintas especies bacterianas evitando la excesiva proliferación de aquellas potencialmente patógenas y obtener así una microflora intestinal sana (9). Este equilibrio se puede restablecer mediante la ingesta de alimentos funcionales o bien microorganismos vivos probióticos o bien mediante el consumo de oligosacáridos prebióticos.

Los prebióticos son ingredientes que son selectivamente fermentados por la microflora intestinal provocando cambios específicos tanto en su composición como en su actividad aportando efectos beneficiosos sobre la salud humana (10). Su consumo produce un aumento en la proporción de bacterias beneficiosas como Lactobacillus y Bifidobacterium frente a otras especies mostrando una mejora en la salud del individuo (11). Conviene diferenciarlos de los probióticos que se definen como organismos exógenos vivos que resisten a la digestión normal alcanzando el colon e influyendo así de manera positiva en la composición de la microflora intestinal (1). Los simbióticos resultan de la combinación de probióticos y prebióticos en un mismo producto para mejorar la supervivencia e implantación de los microrganismos en el tracto gastrointestinal.  Los principales efectos benificiosos de los prebióticos se deben a la presencia de una flora predominantemente bifidogénica. Estos efectos se pueden dividir en tres: la acción inmunoprotectora la acción metabólica por la producción de AGCC y la acción nutricional ya que las bifidobacterias favorecen la síntesis de algunas vitaminas como B6 B12 etc. y ayudan a la absorción de Ca Mg Fe y Zn. Además los prebióticos son bajos en calorías y anticariogénicos. 

Los prebióticos tienen una serie de ventajas frente a los probióticos: estimulan a toda la microbiota no sólo a una cepa; son más estables y se  pueden añadir como aditivos a una gama más amplia de productos; y es más fácil que lleguen intactos al colon que las bacterias que tienen que sobrevivir al tracto digestivo.

En la Tabla 1 se detallan los carbohidratos aceptados como prebióticos hasta el momento. Los fructanos tipo inulina se encuentran en numerosas especies vegetales la oligofructosa se obtiene de la hidrólisis parcial de la inulina los FOS y GOS a partir de la síntesis enzimática de sacarosa y lactosa respectivamente y la lactulosa se obtiene industrialmente por isomerización de la lactosa.

Los FOS son oligosacáridos de D-fructosa (F) con una D-glucosa (G) terminal en los que los grupos fructosilo se unen mediante enlaces glicosídicos β(2→1) formando la serie ¹F-FOS. Cuando la unión se realiza mediante enlaces β(2→6) se denomina serie ⁶F-FOS si se trata de una fructosa y ⁶G-FOS cuando la unión tiene lugar con la glucosa (12) representándose algunas de estas estructuras en la Figura 2.

Tabla 1. Clasificación de carbohidratos aceptados como prebióticos (10).

La obtención de FOS se lleva a cabo mediante la síntesis enzimática a partir de sacarosa. Las enzimas más empleadas para la obtención industrial de FOS son las fructosiltransferasas más concretamente las sacarosa fructosiltransferasas (EC 2.4.1.99) y las β-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26). La reacción de transfructosilación mediada por estas enzimas tiene lugar en dos pasos (13) formándose un intermedio fructosil-enzima por unión covalente de una molécula de fructosa al centro activo de la enzima y liberándose una molécula de glucosa. En el segundo paso se produce un ataque nucleofílico por un carbohidrato que actúa como molécula aceptora del fructosilo dando lugar a la síntesis del FOS correspondiente. En caso de que el nucleófilo sea una molécula de agua se forma la fructosa. La preferencia por una molécula de agua o de carbohidrato como molécula aceptora viene determinada por la tasa transferencia/ hidrólisis de la enzima. Así se buscan enzimas con elevada tasa de transferencia/ hidrólisis.

La mayoría de los FOS que se encuentran en el mercado son de tipo inulina tal como se observa en la Tabla 2 recomendándose un consumo diario de 10 g/ día (14).

Las levansacarasas (EC. 2.4.1.10) son enzimas que pertenecen a la familia de las hexosiltransferasas y que se encuentran en microorganismos como Bacillus subtilis Zymomonas mobilis Microbacterium laevaniformans o Bacillus licheniformis(15-17). También son conocidas como β-26-fructosiltransferasas porque catalizan la formación de levano un homopolímero de fructosa con enlaces β(2→6) con alguna ramificación β(2→1) (Figura 3) (18). El levano tiene aplicaciones en la industria alimentaria farmacéutica y cosmética además de ser un buen agente antitumoral debido a sus propiedades físicas (19). Aparte de la formación del levano las levansacarasas (LEV) producen FOS como se muestra en la Figura 3.

Los FOS producidos por LEV son el producto de la transfructosilación de un grupo fructosilo a una molécula de sacarosa o a otro FOS respondiendo a la fórmula  GF_n con n de 1 a 10. El tipo de enlace glicosílico que se forma entre las fructosas es principalmente del tipo  β(2→6) produciendo entonces 6-kestosa y otros FOS de la misma familia (Figura 3). Sin embargo también se ha descrito la formación de otros FOS como la 1-kestosa y el resto de FOS de tipo inulina neokestosa blastosa etc. (Figura 3) por parte de algunas levansacarasas incluyendo la de Z. mobilis(20). Algunas levansacarasas también presentan actividad hidrolítica sobe el levano produciendo moléculas de fructosa levanbiosa sacarosa oligómeros del levano o levano de bajo peso molecular (21).

La inmovilización de las enzimas productoras de FOS es deseable debido a la creciente demanda de este tipo de productos por la industria y los consumidores. La inmovilización de enzimas presenta una serie de ventajas frente a la utilización de enzimas solubles: aumenta la estabilidad de la enzima favorece la recuperación del producto y disminuye el coste total del proceso ya que el biocatalizador se puede reutilizar. Hay diferentes maneras de inmovilizar enzimas: por atrapamiento por adsorción en superficies por enlaces covalentes a un soporte o por enlaces covalentes entre ellas mismas para formar agregados.

La inmovilización por enlaces covalentes es más estable y reproducible que la inmovilización por adsorción o atrapamiento. Sin embargo presenta la desventaja de que puede afectar a la estructura de la enzima al interaccionar con el soporte. Además muchas veces los tipos de enlaces que se forman requieren condiciones de reacción que no son favorables para la enzima. Por ejemplo para la formación de enlaces de tipo base de Schifft entre un aldehído de un soporte y un grupo amino de una enzima se requiere que el pH de la reacción sea de 10. A ese pH muchas enzimas pierden irreversiblemente su actividad.

Tabla 2. Prebióticos con estructura tipo inulina comercializados actualmente.

Ya que las principales industrias consumidoras de FOS son la alimentaria y la farmacéutica las técnicas por las que se producen los FOS tienen que ser adecuadas para el consumo humano evitando el uso de disolventes orgánicos o de sustancias tóxicas. La inmovilización por atrapamiento en geles de alginato cálcico ha sido reconocida como apta para el consumo humano (GRAS Generaly Recognized as Safe) y se usa ampliamente en la conocida como gastronomía molecular. Sin embargo una de las desventajas de esta técnica es que si la enzima no es lo suficientemente grande puede lixiviar de las esferas de alginato. La levansacarasa de Z. mobilistiene una propiedad descrita por Goldman et al.(22) por la cual a valores de pH por debajo de 5.0 forma microfibras que aumentan su peso molecular pudiendo evitar así su lixiviación. Otra estrategia para aumentar el tamaño de las proteínas es entrecruzarlas con glutaraldehído o más recientemente con transglutaminasas (TG). Las TGs son enzimas (EC 2.3.2.13) que catalizan la formación de enlaces covalentes entre grupos amino libres y el grupo γ-carboxiamida de las proteínas o de una glutamina de una proteína. Los productos entrecruzados normalmente con alto peso molecular son muy resistentes al esfuerzo mecánico y a la degradación proteolítica (23). Las TGs ya se han usado para inmovilizar enzimas pero principalmente para unir covalentemente las enzimas a una matriz (24). Las TGs también son GRAS y se utilizan en la industria alimentaria para el procesamiento de carne pescado y lácteos.

Los objetivos de este trabajo fueron caracterizar la enzima levansacarasa de Zymomonas mobilis estudiar la síntesis enzimática de fructooligosacáridos catalizada por dicha enzima y optimizar la reacción para su uso en la industria mediante estrategias de inmovilización.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Enzimas y reactivos

La enzima levansacarasa de Zymomonas mobilis se adquirió como un preparado comercial de extracto extracelular en polvo de Amano (Japón). Los azúcares sacarosa glucosa fructosa 1-kestosa y nistosa eran de Sigma. La 6-kestosa la neokestosa y la blastosa fueron aisladas e identificadas previamente en el laboratorio. La transglutaminasa se compró a la empresa japonesa Ajinomoto con el nombre comercial de Activa WM. El alginato sódico (Protanal LF 120 LS) se adquirió de FMC BioPolymer (USA). Todos los reactivos eran de la máxima pureza disponible en el mercado.

2.2. Caracterización de la enzima

La actividad catalítica de la preparación enzimática se determinó con el método del ácido 35-dinitrosalicílico (DNS) para azúcares reductores descrito por Miller (25) con sacarosa 100 g/l como sustrato. La actividad (U/mg) se definió como los mmol de azúcares reductores producidos en 1 minuto por miligramo de biocatalizador sólido comercial. La concentración de proteína total se determinó mediante el método de Bradford (26) con el reactivo de Bio-Rad. El peso molecular de la proteína se estimó analizando la preparación enzimática en un gel de poliacrilamida 10% con SDS teñido con Protoblue™ Safe (National Diagnosis) y comparando el tamaño de la banda principal con marcadores de peso molecular de proteínas (Novagen). La transferencia a una membrana de PVDF (Bio-Rad) se realizó con el Trans-Blot^® Turbo™ Transfer System (Bio-Rad). La membrana se tiñó con Coomassie y las bandas de interés se cortaron y se enviaron a un laboratorio externo para los análisis de secuenciación del dominio N-terminal.

Se calcularon las condiciones óptimas de pH y temperatura en términos de actividad y estabilidad. Para la estabilidad frente al pH se prepararon las siguientes soluciones tampón: acetato sódico 50 mM a  pH 3.0 3.6 4.0 4.4 y 5.0; y fosfato sódico 50 mM a pH 5.0 6.0 7.0 y 8.0. La enzima se incubó durante 24 h a 35ºC en cada uno de los tampones y se midió la actividad residual con el método del DNS. Para el pH óptimo la actividad en sacarosa 100 g/l (1 ml) se midió a 35ºC durante 20 min en los tampones descritos previamente. Posteriormente se midió la actividad por el método del DNS. Para medir la estabilidad frente a la temperatura la enzima se incubó durante 1 h a diferentes temperaturas entre 4-75ºC y a pH 5.0 y la actividad residual se midió por el método del DNS. Para determinar la temperatura optima se incubaron reacciones de 1 ml con sacarosa 100 g/l a diferentes temperaturas (25-75ºC) y pH 5.0. La actividad de cada una de las reacciones se midió por el método del DNS.

2.3. Identificación y cuantificación de los productos de reacción

La identificación de los productos de la reacción de la levansacarasa con sacarosa como sustrato se llevó a cabo mediante cromatografía de intercambio aniónico con un detector amperométrico de pulsos (HPAEC-PAD). Los oligosacáridos se analizaron empleando la columna CarboPack PA1 y los oligosacáridos y polisacáridos con la CarboPack PA200. Cinco unidades de levansacarasa (soluble o inmovilizada) por ml de reacción se añadieron a una solución de sacarosa 600 g/l en tampón acetato sódico 50 mM  pH 5.6 y se incubó a 40ºC con agitación suave. Se tomaron muestras a diferentes tiempos que fueron inactivadas con Na₂CO₃ 0.4 M filtradas en tubos de centrífuga con filtros de celulosa (0.45 mm National Scientific) y diluidas con agua antes de ser inyectadas en el equipo cromatográfico. Las fases móviles utilizadas para cada columna se muestran en la Tabla 3. Sólo fue posible la cuantificación de aquellos productos de los que se disponía del estándar correspondiente para realizar una curva de calibrado. La concentración de los productos desconocidos se estimó como la diferencia entre la cantidad inicial de sacarosa y la suma de los productos conocidos. La actividad hidrolítica se determinó a partir de la cantidad de fructosa libre. La actividad de transfructosilación se calculó con la diferencia entre las cantidades de glucosa y fructosa libres. La tasa de transfructosilación/ hidrólisis se definió como el cociente entre ambas actividades.

Algunos de los productos de reacción desconocidos se purificaron mediante HPLC semipreparativa con una bomba Delta 600 (Waters) y un detector de índice de refracción (Varian). La columna semipreparativa era una Kromasil NH₂ 5 mm (250 x 10 mm) y la fase móvil era acetonitrilo:agua 68:32 (v/v). Los productos aislados se enviaron a un laboratorio externo para los análisis de espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear (RMN).

 2.4. Entrecruzamiento de la enzima con transglutaminasa (TG)

Para el entrecruzamiento de LEV se añadieron diferentes cantidades de transglutaminasa (100 U/g) a una solución de LEV y se incubaron durante 1 h a 35ºC con agitación suave. Los productos del entrecruzamiento se visualizaron electroforéticamente en condiciones nativas y desnaturalizantes. La presencia de actividad se determinó con el reactivo cloruro de 235-tripheniltetrazolio (TTC) tras una incubación en sacarosa siguiendo el protocolo descrito por Mukasa et al.(27). Las reacciones se dejaron toda la noche a 4ºC para observar la precipitación de conglomerados de alto peso molecular.

Tabla 3. Composición de la fase móvil para HPAEC-PAD. A NaOH 200 mM; B agua; C acetato sódico (AcONa) 200 mM; D AcONa 320 mM en NaOH 100 mM.

2.5. Inmovilización

La enzima se inmovilizó por atrapamiento en alginato cálcico goteando una disolución 1:1 de enzima:alginato sódico 4% (p/v) sobre una disolución de CaCl₂ 200 mM. Este protocolo se siguió para la inmovilización de LEV a pH 4.0 a pH 5.6 y de LEV tras el entrecruzamiento con TG. El rendimiento de la inmovilización se calculó midiendo la actividad y la cantidad de proteína presente en las distintas soluciones de inmovilización y comparándolo con los datos de la solución enzimática inicial. Se utilizaron diferentes concentraciones iniciales de LEV y se determinó que la concentración más eficiente era 100 mg/ml de preparación enzimática ya que algo de la actividad se perdía con la incubación con TG. 

Las esferas de alginato se deshidrataron mediante aireación forzada para formar “DALGEEs” (Dry ALGinate Entrapped Enzymes) (28) y se estudió su actividad y su estabilidad. El ensayo de lixiviación consistió en ciclos secuenciales de reacciones en batch y de lavados con sacarosa: los DALGEEs se incubaron con  500 ml de sacarosa 600 g/l en las condiciones óptimas de reacción durante 20 min a 40ºC y 600 rpm durante cada ciclo de reacción. El medio de reacción se extrajo para analizar su actividad residual mediante el método del DNS y los biocatalizadores se lavaron dos veces con sacarosa fría antes de comenzar otro ciclo.

2.6. Visualización de los biocatalizadores con microscopía electrónica de barrido (SEM)

La visualización fue posible con la ayuda del Laboratorio de Técnicas No Destructivas del Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid (CSIC). Las esferas de alginato se observaron con el FEI INSPECT un SEM que puede trabajar a bajo vacío (0.08 a 0.60 torr) y que dispone de un detector de electrones secundarios y otro de backscaterring. Tanto las esferas de alginato como los DALGEEs se analizaron con el FEI QUANTA 200 un SEM que puede operar a tres modos de vacío: alto vacío bajo vacío (0.08 a 1 torr)  y a condiciones ambientales o ESEM (1 a 20 torr) con un detector de electrones secundarios y otro de backscattering. Las esferas de alginato se analizaron en condiciones ambientales y los DALGEEs a bajo vacío porque la resolución era mejor. Este microscopio estaba acoplado a un detector de masas que funcionaba al trabajar a bajo vacío y que podía analizar fácilmente cualquier porción de la muestra.

3. RESULTADOS

3.1. Actividad catalítica y condiciones óptimas de la enzima soluble

Se estudió el efecto de la temperatura en la actividad y estabilidad de la enzima soluble (Figura 4). Aunque observando las gráficas se puede comprobar que la temperatura óptima de LEV era 54ºC la enzima no era estable a temperaturas superiores a 44ºC (Figura 4A). En cuanto al pH el valor óptimo y el de máxima estabilidad era el mismo pH 5.6 (Figura 4B). Por lo tanto las condiciones seleccionadas para operar con la enzima soluble se fijaron en 40ºC y pH 5.6. Bajo estas condiciones la actividad catalítica de enzima era 6.68 U por mg de preparado comercial. La preparación enzimática tenía un contenido en proteína del 6.25% (p/p).

El peso molecular de la levansacarasa suponiendo que ésta es la banda mayoritaria era aproximadamente de 45 kDa según SDS-PAGE (Figura 5A flecha roja). Aparte de la banda mayoritaria se podían observar otras proteínas contaminantes en la preparación enzimática. Para dilucidar cuál de las bandas tenía actividad se hizo un zimograma y se encontraron tres bandas capaces de producir azúcares reductores (Figura 5B carril 1). Un gel en condiciones nativas se transfirió a una membrana de PVDF se recortaron las bandas de interés y se enviaron a un laboratorio externo (Microbial Interactions and Processes Research Group HZI Alemania) para la secuenciación de su dominio N-terminal. Los resultados mostraron que las tres bandas correspondían a secuencias de levansacarasa por lo que se deduce que pueden ser isoformas de la misma. Con esto se concluye que toda la actividad que presenta la preparación enzimática de Amano® se puede atribuir a la enzima levansacarasa de Z. mobilis.

3.2. Producción de fructooligosacáridos por la levansacarasa soluble

Se analizó una reacción con sacarosa 600 g/l y 5 U/ml de LEV soluble en tampón acetato 50 mM pH 5.6. Con la ayuda de estándares se identificaron los oligosacáridos 1-kestosa 6-kestosa blastosa neokestosa y nistosa mediante HPAEC-PAD con la columna CarboPack PA1 (Figura 6A). Se formaban también otros productos para los que no disponíamos de estándares. El pico 13 se purificó por HPLC semipreparativa y se envió a un servicio externo para la identificación por masas y RMN. Los resultados de espectrometría de masas mostraron que el pico 13 era un tetrasacárido (MW = 666 g/mol). Finalmente los resultados de RMN confirmaron que se trataba de la 66-nistosa.

La producción de FOS por la enzima soluble alcanzó su máximo cuando el 85% de la sacarosa se había consumido y la tasa de transfructosilación/hidrólisis era 2.2. El FOS más abundante en la reacción era 6-kestosa seguido de 1-kestosa y neokestosa (Figura 7 triángulos). Además el pico de blastosa era bastante importante en la reacción pero no disponíamos de cantidad suficiente para cuantificarlo.

Aparte de estos FOS se puede observar en los cromatogramas que la enzima es capaz de formar otros oligosacáridos de mayor grado de polimerización que no se pueden identificar. Dado que uno de los productos descritos para la levansacarasa es el levano se intentaron visualizar oligosacáridos cada vez más largos. Para ello se utilizó HPAEC-PAD con la columna CarboPack PA200.

Como estándar para aproximar el grado de polimerización se utilizó inulina (Raftiline® Orafti) (Figura 6B cromatograma gris) donde se puede observar toda la serie de la inulina desde GF2 hasta GF60. Las mismas muestras recogidas para el análisis de los FOS se analizaron con la nueva columna (Figura 6B). Al ser una columna más resolutiva además de los FOS identificados en el experimento anterior también se pudieron identificar la difructosa (F2) fructosilnistosa (GF4) y la neonistosa; además de diversos productos de la serie de la inulina (GFn y Fn). En la Figura 6B se puede observar cómo van apareciendo picos de azúcares cada vez más largos tanto de la serie de la inulina (¹F-FOS) como otros sin identificar que probablemente pertenezcan la serie ⁶F-FOS. Sin embargo el levano de peso molecular mucho más elevado no se pudo visualizar con este tipo de cromatografía.

3.3. Entrecruzamiento de la levansacarasa con transglutaminasa

Debido al reducido tamaño de LEV para su inmovilización por atrapamiento la enzima se entrecruzó usando la enzima transglutaminasa. Se probaron diferentes proporciones de ambas enzimas y LEV conservaba altos niveles de actividad (medida por DNS) incluso tras la adición de grandes cantidades de TG (resultados no incluidos). Para analizar el tamaño de los agregados las reacciones se estudiaron electroforéticamente. Aparecieron las mismas bandas que en el carril de LEV pero además se podía ver un conglomerado que no era capaz de penetrar en el gel (Figura 5A flecha negra). Para comprobar si esa banda era activa se estudió la actividad con un zimograma (Figura 5B carriles 2 3 y 4 flecha negra). La banda del agregado formado por entrecruzamiento era una vez más incapaz de entrar en el gel pero se pudo detectar actividad. Sin embargo una cantidad importante de LEV quedaba sin entrecruzar incluso tras el tratamiento con 40 U/ml de TG. También se pudo observar la precipitación de proteínas de alto peso molecular cuando los eppendorfs con las reacciones se dejaban por la noche en el frigorífico (Figura 8A).

3.4. Cambio de la estructura cuaternaria de LEV con el pH

Según Goldman y cols.(22) la levansacarasa de Z. mobilis existe en dos formas dependiendo del pH. A valores de pH por debajo de 5.0 forma microfibras que aumentan su tamaño mientras que a pH por encima de 5.0 la enzima se encuentra principalmente en forma de dímero soluble. Para observar este efecto se incubó LEV en tampones a diferentes pH y se dejaron toda la noche. Se observaron precipitados a pH 4.0 y en menor medida a pH 5.0 (Figura 8B) aunque en ambos casos significativamente menos que tras el entrecruzamiento con TG. También se incubó LEV sola en las mismas condiciones para comparar los resultados.

3.5. Inmovilización

La enzima LEV se inmovilizó siguiendo las dos estrategias descritas para aumentar su tamaño: entrecruzamiento con TG y ajustando el pH por debajo de 5.0. La enzima también se inmovilizó en su forma soluble a pH 5.6 para comparar los resultados. Primero se inmovilizaron por atrapamiento para formar esferas de alginato (Figura 11E izq.). Aunque el rendimiento de la inmovilización fue superior al 90% (Tabla 4) estas esferas demostraron no mostraron una gran estabilidad operacional en batch; las tres estrategias perdían la enzima durante los primeros 4 ciclos de reacción  (Figura 9A).  Para intentar evitar el problema de la lixiviación  las esferas de  alginato se secaron para formar DALGEEs (Dry ALGinate Entrapped Enzymes) (Figura 11E dcha.). Esta estrategia resultó ser más eficaz. El tamaño de los DALGEEs es aproximadamente un tercio de las bolas de alginato (Figura 11). Los mejores resultados de actividad frente a lixiviación se obtuvieron con la estrategia de la TG. Tras 15 ciclos de reacción el biocatalizador conservaba el 85% de su actividad inicial (Figura 9B) es decir aproximadamente 18 U por gramo de biocatalizador. El aumento de actividad tras el primer ciclo de reacción se puede explicar por la hidratación de los DALGEEs al entrar en contacto con el medio líquido de la reacción y por lo tanto la ligera relajación de la red de alginato que facilita el intercambio entre sustratos y productos. Los DALGEEs a pH 4.0 tenían más actividad al principio pero al estudiar la lixiviación con sacarosa 600 g/l a pH 4.0 la sacarosa daba señal en el ensayo de DNS probablemente como consecuencia de una hidrólisis ácida haciendo imposible el análisis de los datos (resultados no incluidos).

Tabla 4. Rendimiento de la inmovilización de LEV en alginato cálcico. La actividad se midió en dos puntos durante la inmovilización: tras la incubación con TG y tras la inmovilización.

	Rendimiento de incubación *	Rendimiento de inmovilización	Rendimiento total
LEV	58%	94%	55%
LEV + TG	59 %	92%	54%

*   Tras 2 h de incubación con TG a 35ºC pH 5.6 600 rpm

3.5. Producción de fructooligosacáridos por la levansacarasa inmovilizada

Una vez que la enzima estuvo inmovilizada se estudiaron reacciones en las mismas condiciones que con la enzima soluble y las muestras se analizaron por HPAEC-PAD. Básicamente se formaron los mismos productos que con la enzima soluble solo que en distinta proporción (Figura 7 círculos negros y blancos). Además las reacciones con biocatalizadores inmovilizados parecían ir más rápidas a pesar de haber puesto las mismas unidades. Esto pudo ser causado por el efecto observado en el ensayo de lixiviación por el cual la actividad aumentaba tras el primer ciclo de reacción.

Aunque inicialmente ambas reacciones (con la enzima soluble e inmovilizada) se estudiaron con el mismo número de unidades de LEV por ml este efecto puede haber causado que la actividad de los DALGEEs fuera en realidad mayor que la que se calcula con un solo ensayo de DNS. Sin embargo lo que parece bastante claro es que la enzima es capaz de consumir casi toda la sacarosa presente en la reacción y permanece activa incluso después de 129 h de reacción (datos no mostrados). No hubo diferencias significativas entre los productos formados por LEV inmovilizada sola y LEV previamente entrecruzada con TG aunque se pudo observar un ligero aumento en la producción de FOS en la estrategia con TG que tenían una tasa de transfructosilación/ hidrólisis de 1.8.

La producción de FOS con LEV inmovilizada alcanzó su máximo cuando casi toda la sacarosa se había consumido (Figura 10B) y la tasa de transfructosilación hidrólisis era de 1.6. Una vez que la conversión de sacarosa fue total la concentración de 1-kestosa y neokestosa empezó a caer (Figuras 7A y 7C) mientras que la concentración de 6-kestosa parecía aumentar (Figura 7B). Esto indica que probablemente LEV está actuando sobre la 1-kestosa produciendo oligosacáridos más largos. Estos oligosacáridos se pueden observar en los tiempos largos de retención de los cromatogramas (Figura 6) pero como su identidad es desconocida no se puede saber su concentración exacta.

Figura 10. Variación de la concentración de sacarosa glucosa fructosa y suma de FOS conocidos frente al tiempo de reacción. Reacción con LEV soluble (primer gráfico). Reacción con LEV inmovilizada (segundo gráfico).

3.6. Visualización de los biocatalizadores mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)

Las esferas de alginato son muy difíciles de observar con microscopía electrónica debido a su alto contenido en agua (90%). Las condiciones de alto vacío dentro de los microscopios hacen que las esferas se deshidraten y se pierda la estructura original de la red de alginato cálcico. Sin embargo con las condiciones de bajo vacío del SEM FEI INSPECT las bolas de alginato se pudieron visualizar cuando habían perdido solo un tercio de su volumen (Figura 11A) y se puede apreciar lo que parece que son los poros por los que se podría estar produciendo la difusión de sustratos y productos. Cuando se intentó observar las bolas de alginato en condiciones ambientales la resolución no era muy buena (no se muestra la imagen).

Los DALGEEs se observaron con en un microscopio SEM FEI QUANTA 200 en condiciones de bajo vacío (Figura 11 B-D). A pesar de acercarse bastante a la superficie no se pudo detectar ningún poro. Sin embargo se pueden ver unas franjas paralelas que pueden ser producto de la deshidratación pero también nos podría estar dando una idea de la estructura interna de la red de alginato. Algunos DALGEEs presentaban cristales de NaCl y de  CaCl₂ en la superficie procedentes de los tampones y disoluciones utilizados durante la inmovilización.

4. DISCUSIÓN

Los datos obtenidos en la caracterización de la levansacarasa de Z. mobilisparecen concordar con estudios previos sobre esta enzima (16, 20, 29, 30).

En cuanto a las tres bandas con actividad reductora de azúcares presentes en el gel de actividad se enviaron a un laboratorio externo para secuenciar su extremo N-terminal y comprobar qué clase de enzimas son probablemente las dos más importantes correspondan a las dos levansacarasas de Z. mobilis descritas en su genoma (números de acceso en GeneBank AAV88999.2  y AAV88998.1 (31). 

En cuanto a la producción de FOS se encontró cierta discordancia entre los resultados publicados previamente y nuestros resultados. Además nunca antes se había hecho un estudio cromatográfico en detalle. Mientras que en la bibliografía la 6-kestosa está definida como el principal producto de LEV (20) encontramos que esto era verdad solo durante las primeras horas de reacción usando la enzima soluble. Por el contrario con la enzima inmovilizada el principal producto era la 1-kestosa.

También hubo diferencias en las cantidades de FOS producidas por la enzima soluble e inmovilizada. La enzima soluble sintetizaba considerablemente más 6-kestosa y neokestosa que la enzima inmovilizada. También se producía ligeramente más 1-kestosa con la enzima soluble pero no de manera significativa. Por otra parte la nistosa presentaba prácticamente la misma tasa de producción en todas las reacciones. Esto significa un cambio de selectividad en la producción de trisacáridos cuando la enzima se inmoviliza.

En cuanto a la producción de azúcares más largos con el uso de la columna CarboPack PA200 se pudo visualizar el crecimiento de los FOS hasta un grado de polimerización de aproximadamente GF20. Muestras de tiempos más largos no mostraban tantos picos de alto grado de polimerización. Esto puede ser debido a que todo se ha transformado ya en levano de más peso molecular que no es posible visualizar por cromatografía.

Cuando la enzima se inmovilizó por atrapamiento en alginato cálcico se observaba lixiviación incluso cuando LEV había sido entrecruzada con TG. Sin embargo con la estrategia de los DALGEEs previo entrecruzamiento con TG se conservaba un 85% de la actividad tras 15 ciclos de reacción. Siempre se obtenía el mismo perfil de actividad en el que el segundo ciclo de reacción daba más actividad que el primero. Una posible explicación a este fenómeno es que cuando las esferas se secan y se quedan compactas algunas moléculas de enzimas no son accesibles para el sustrato. Cuando los DALGEEs se incuban en una disolución de sacarosa en el primer ciclo se rehidratan ligeramente haciendo la red de inmovilización más flexible y facilitado la difusión de sustratos y productos. Es interesante comprobar que los DALGEEs no vuelven a su forma original de esferas de alginato totalmente hidratadas debido a la baja actividad del agua (a_w) de la disolución de sacarosa empleada.

5. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos la enzima levansacarasa es muy adecuada para la producción a escala industrial de FOS. A diferencia de otras enzimas relacionadas (p.ej. β-fructofuranosidasas) la levansacarasa produce una mezcla compleja de productos que podrían tener efectos sinérgicos en cuanto a sus propiedades prebióticas. La amplia gama de FOS producidos por esta enzima abre posibilidades más allá de los FOS de la familia de la inulina en los que están centrados la mayor parte de los productos actualmente comercializados.

De las estrategias de inmovilización ensayadas la mejor fue el entrecruzamiento con TG siguiendo la mertodología de los DALGEEs aunque una cantidad importante de LEV quedara sin entrecruzar. Esta estrategia no solo no afectó a la actividad de LEV sino que parecía aumentar ligeramente la producción de FOS en comparación con la enzima inmovilizada sin entrecruzar. El cambio en la selectividad puede ser interesante si se requiere la producción de un tipo de FOS en particular como por ejemplo la 1-kestosa o la nistosa.

El método de inmovilización propuesto que combina atrapamiento en alginato cálcico con entrecruzamiento con tranglutaminasa es muy interesante para la producción de FOS y su aplicación a la industria alimentaria debido a que todos los materiales son aptos para el consumo humano. La optimización de esta técnica supondría una fácil producción de FOS prebióticos a partir de un sustrato barato y fácilmente accesible como es la sacarosa.

También sería interesante optimizar la producción del polisacárido sintetizado por la levansacarasa  (levano) debido a su capacidad antitumoral (19) anticolesterolémica antioxidante (32) y antidiabética entre otras. Dichos procesos permitirían reducir el elevado precio que tiene el levano a día de hoy.

6. AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado con proyecto del Ministerio de Ciencia e Innovación (BIO2010-20508-C04-01) y otro del Ministerio de Economía y Competitividad (BIO2013-48779-C4-1-R). Agradecemos a Amano (Japón) por su amable donación de la enzima levansacarasa.

7. REFERENCES

1. Fuller R. Probiotics in man and animals. The Journal of Applied Bacteriology 1989; 66: 365-78.

2. Cummings J H, Macfarlane G T. The control and consequences of bacterial fermentation in the human colon. The Journal of Applied Bacteriology 1991; 70: 443-59.

3. Gibson G R, Rastall R A. Prebiotics: development and application. Chichester: John Wiley & Sons 2006.

4. Macfarlane G T, Steed H. Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics. Journal of Applied Microbiology 2008; 104: 305-44.

5. Mayo B, Delgado S. Probioticos y salud. Alimentacion nutrición y salud 2003; 10: 61-70.

6. Guarner F. [The colon as an organ: habitat of bacterial flora]. Nutrición Hospitalaria 2002; 17: 7-10.

7. Ottman N, Smidt H. The function of our microbiota: who is out there and what do they do? Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2012; 2: 104.

8. Arumugam M, Raes J. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature 2011; 473: 174-80.

9. Zoppi G. Probiotics and prebiotics in the treatment of infections due to vancomycin-dependent Enterococcus faecalis and of imbalance of the intestinal ecosystem (dysbiosis). Acta paediatrica 1997; 86: 1148-50.

10. Roberfroid M. Prebiotics: the concept revisited. The Journal of Nutrition 2007; 137: 830s-7s.

11. Gibson G R, Roberfroid M B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. The Journal of Nutrition 1995; 125: 1401-12.

12. Plou F J, Segura A G. Application of Glycosidases and Transglycosidases in the Synthesis of Oligosaccharides. In: Polaina J. MacCabe A. Eds. Springer Netherlands; 2007: p. 9

13. Plou F J, Martín M T. Glucosyltransferases acting on starch or sucrose for the synthesis of oligosaccharides. Canadian Journal of Chemistry 2002; 80: 743-752.

14. Bouhnik Y, Raskine L. The capacity of short-chain fructo-oligosaccharides to stimulate faecal bifidobacteria: a dose-response relationship study in healthy humans. Nutrition Journal 2006; 5: 8.

15. Park H E, Park N H. Enzymatic synthesis of fructosyl oligosaccharides by levansucrase from Microbacterium laevaniformans ATCC 15953. Enzyme and Microbial Technology 2003; 32: 820-827.

16. Lyness E W, Doelle H W. Levansucrase from Zymomonas mobilis. Biotechnology letters 1983; 5: 345-350.

17. Chambert R, Treboul G. Kinetic studies of levansucrase of Bacillus subtilis. European Journal of Biochemistry 1974; 41: 285-300.

18. Han Y W. Microbial levan. Advances in Applied Microbiology 1990; 35: 171-94.

19. Dahech I, Belghith K S. Partial purification of a Bacillus licheniformis levansucrase producing levan with antitumor activity. International Journal of Biological Macromolecules 2012; 51: 329-335.

20. Bekers M, Laukeviks J. Fructooligosaccharide and levan producing activity of Zymomonas mobilis extracellular levansucrase. Process Biochemistry 2002; 38: 701-706.

21. Jang K H, Ryu E J. Levan fructotransferase from Arthrobacter oxydans J17-21 catalyzes the formation of the di-D-fructose dianhydride IV from levan. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003; 51: 2635-2636.

22. Goldman D, Lavid N. Two active forms of Zymomonas mobilis levansucrase. The Journal of biological chemistry 2008; 283: 32209-32217.

23. Griffin M, Casadio R. Transglutaminases: Nature’s biological glues. Biochemical Journal 2002; 368: 377-396.

24. Kamata Y, Ishikawa E. Enzyme immobilization on ion exchangers by forming an enzyme coating with transglutaminase as a crosslinker. Biosciences Biotechnology and Biochemistry 1992; 56: 1323-1324.

25. Miller G. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry 1959; 31: 426-428.

26. Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry 72 248-54 (1976)

27. Mukasa H, Shimamura A. Direct activity stains for glycosidase and glucosyltransferase after isoelectric focusing in horizontal polyacrylamide gel layers. Analytical Biochemistry 1982; 123.

28. Fernández-Arrojo L, Rodríguez-Colinas B. Dried alginate-entrapped enzymes (DALGEEs) and their application to the production of fructooligosaccharides. Process Biochemistry 2013; 48: 677-682.

29. Yanase H, Iwata M. Purification crystallization and properties of the extracellular levansucrase from Zymomonas mobilis. Biosciences Biotechnology and Biochemistry 1992; 56: 1335-1337.

30. Crittenden R G, Doelle H W. Identification and characterisation of the extracellular sucrases of Zymomonas mobilis UQM 2716 (ATCC 39676). Applied Microbiological Biotechnology 1994; 41: 302-308.

31. Seo J S, Chong H. The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4. Nature Biotechnology 2005; 23: 63-8.

32. Belghith K S, Dahech I. Microbial production of levansucrase for synthesis of fructooligosaccharides and levan. International Journal of Biological Macromolecules 2012; 50: 451-8.