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About the vibrational spectroscopy in the diagnosis of AlzheimerÕs disease

Title in Spanish: Sobre la espectroscop’a vibracional en el diagn—stico de la enfermedad de Alzheimer

P. Carmona1*, E. L—pez-Tobar1, M. Molina2, A. Toledano3,4

1Instituto de Estructura de la Materia (CSIC), Serrano 121, 28006 Madrid. 2Escuela Universitaria de îptica, Universidad Complutense,  Madrid.

3Instituto Cajal (CSIC), Av. Dr. Arce 37, 28002 Madrid.4AcadŽmico Correspondiente de la RANF

*Corresponding Author: p.carmona@iem.cfmac.csic.es          An Real Acad Farm Vol. 81, N¼ 1 (2015), pp. 19-24

Received:  January 21, 2015  Accepted: February 24, 2015      Language of Manuscript: Spanish

 



1. INTRODUCCIîN

En los pr—ximos 50 a–os se espera que la enfermedad de Alzheimer (EA) afecte a 100 millones de personas en el mundo. Es de sobra conocido que las caracter’sticas patofisiol—gicas m‡s importantes de la enfermedad de Alzheimer son las placas seniles y los ovillos neurofibrilares. El componente mayoritario de dichas placas es el pŽptido β-amiloide (Aβ). Este pŽptido de 39-43 amino‡cidos es muy hidrof—bico, se libera en la escisi—n proteol’tica de la prote’na precursora amiloidea (APP) y se agrega para formar olig—meros. Estos olig—meros a su vez se agregan para formar fibras, que se depositan en el parŽnquima cerebral y originan las placas seniles (1). Los efectos neurot—xicos del pŽptido Ab implican tambiŽn cambios en la composici—n y estructura de las membranas neuronales, afectando a sus propiedades fisicoqu’micas. Uno de los mayores retos respecto a esta enfermedad neurodegenerativa reside en la consecuci—n de un mŽtodo de diagn—stico precoz con vistas a la administraci—n de un tratamiento adecuado. En la actualidad el diagn—stico definitivo m‡s eficaz est‡ limitado a un examen post-mortem. En la enfermedad de Alzheimer, el diagn—stico cl’nico se hace por exclusi—n tras estudiar el especialista si existe una demencia y no encontrar ningœn s’ntoma o signo que explique la causa de la misma.

Otros procedimientos actuales incluyen la identificaci—n de marcadores para el diagn—stico cl’nico precoz de la EA utilizando tŽcnicas de imagen tales como las de resonancia magnŽtica nuclear (RMN) y tomograf’a por emisi—n de positrones (PET) (2). Pero estos procedimientos son generalmente muy caros, y la disponibilidad de instrumentaci—n al respecto no se ha generalizado. Existen tambiŽn tŽcnicas alternativas de diagn—stico de la EA tales como pruebas genŽticas y ensayos neuroqu’micos de fluidos corporales. En el caso de las pruebas genŽticas, existe una asociaci—n significativa del alelo Žpsilon 4 (e4) de la apolipoprote’na E (ApoE) con la EA de inicio tard’o, pero la genotipificaci—n de la ApoE no se recomienda actualmente como estrategia regular de la EA debido a la baja sensibilidad y especificidad (3).

Los biomarcadores en fluidos corporales tales como LCR, plasma y suero podr’an ser utilizados para incrementar la exactitud del diagn—stico del deterioro cognitivo leve (DCL) y la predicci—n de su evoluci—n. El LCR  es un buen recurso para la investigaci—n en enfermedades neurodegenerativas, pero su aplicaci—n cl’nica est‡ limitada por la naturaleza invasiva del procedimiento, especialmente en poblaciones de edad avanzada, y la exigencia de personal altamente capacitado, por lo que es inadecuado para la aplicaci—n rutinaria. El plasma es un fluido corporal complejo que contiene prote’nas, pŽptidos, l’pidos y metabolitos que reflejan la actividad fisiol—gica y patolog’a en diversos —rganos corporales, incluyendo el sistema nervioso central (SNC). En seres humanos, aproximadamente 500 mL de LCR se absorben en la sangre diariamente (4), lo que hace a la sangre una fuente adecuada de biomarcadores de enfermedades neurodegenerativas. La facilidad de una punci—n venosa en comparaci—n con una punci—n lumbar permite repetitividad, lo que hace adecuada su aplicaci—n en ensayos cl’nicos para el diagn—stico de la EA y evaluar tratamientos modificadores de esta enfermedad.

La espectroscop’a vibracional (infrarroja y Raman) genera informaci—n anal’tica y estructural como consecuencia de las transiciones fundamentales entre niveles de energ’a vibracional reflejadas en bandas espectrales. Los espectros vibracionales se pueden considerar como huellas digitales utilizables en la identificaci—n cualitativa o an‡lisis cuantitativo de las especies moleculares en cuesti—n. En el caso del plasma sangu’neo utilizado como fuente de marcadores de la EA, los espectros vibracionales correspondientes ser‡n el resultado de la superposici—n de espectros de las prote’nas, pŽptidos, l’pidos y metabolitos contenidos en el mismo. La espectroscop’a infrarroja y Raman en su modalidad bidimensional (2D) permite el an‡lisis de espectros complicados de sistemas biol—gicos complejos como el plasma sangu’neo, revelando incluso peque–os cambios en la composici—n y/o estructura molecular resultantes de procesos patol—gicos, f’sicos y qu’micos que tienen lugar en el organismo (5). En esta publicaci—n se presentan ejemplos que ilustran el uso de la espectroscop’a vibracional de correlaci—n 2D en la bœsqueda de marcadores que pueden ser œtiles para el diagn—stico de la EA.

2. ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL DE CORRELACION BIDIMENSIONAL

La observaci—n directa de una correlaci—n entre una banda determinada y otras bandas del mismo espectro, o entre una banda infrarroja y otra Raman, es posible actualmente mediante la espectroscop’a de correlaci—n bidimensional (2D). Este mŽtodo permite obtener informaci—n anal’tica-estructural variada que no se puede conseguir f‡cilmente a partir de un espectro monodimensional convencional. Aunque la idea b‡sica de la espectroscop’a vibracional de correlaci—n 2D es similar a la de RMN 2D, los mŽtodos de calcular los espectros de correlaci—n son diferentes. En la espectroscop’a vibracional de correlaci—n 2D se calcula una correlaci—n cruzada din‡mica entre variaciones de intensidad de bandas inducidas por una perturbaci—n externa (temperatura, tiempo, etc.) para obtener de este modo un espectro de correlaci—n 2D.

El espectro de correlaci—n puede ser de tipo s’ncrono o as’ncrono. En el espectro s’ncrono aparecen en la l’nea diagonal varios picos llamados picos de autocorrelaci—n que corresponden a bandas correlacionadas consigo mismas. Cuanto mayor es el cambio de intensidad de una banda en respuesta a una perturbaci—n externa (tal como un cambio de temperatura, tiempo, etc.), mayor es la intensidad de su pico de autocorrelaci—n. Obviamente una banda que tiene una gran intensidad no necesariamente muestra un pico de autocorrelaci—n fuerte. Por tanto, las bandas que se solapan en un espectro monodimensional se pueden observar como bandas separadas en espectros de correlaci—n 2D a causa de sus diferentes niveles de respuesta a una perturbaci—n. Los picos localizados fuera de la diagonal se llaman picos cruzados. La existencia de un pico cruzado a (n1, n2) en el espectro s’ncrono significa que dos bandas de frecuencias n1 y n2 cambian de manera similar una con respecto a otra en respuesta a una determinada perturbaci—n. Un pico cruzado puede tener signo positivo o negativo. El signo es positivo cuando las intensidades de ambas bandas aumentan o disminuyen simult‡neamente con una perturbaci—n, y es negativo cuando una banda aumenta mientras que la otra disminuye.

Un espectro de correlaci—n as’ncrono proporciona informaci—n complementaria a la obtenida de un espectro de correlaci—n s’ncrono, y carece de picos de autocorrelaci—n. Un pico cruzado de frecuencias (n1, n2) en un espectro de correlaci—n as’ncrono significa que las intensidades de dos bandas a n1 y n2 presentan respuestas fuera de fase para una determinada perturbaci—n. Por ejemplo, un pico cruzado aparece cuando las intensidades de dos bandas cambian a diferentes temperaturas, o cuando cambian en tiempos diferentes.

La utilidad de esta modalidad de espectroscop’a vibracional se ha traducido en un nœmero creciente de aplicaciones a lo largo de los œltimos lustros en diversas ‡reas relacionadas con la espectroscop’a —ptica (6), bioqu’mica (7) (8) y qu’mica anal’tica (9). A continuaci—n se presentan espectros de correlaci—n s’ncronos infrarrojos y Raman obtenidos a partir de espectros medios de muestras de plasma sangu’neo extra’do de un grupo de 35 pacientes con la EA (8, 16 y 11 en fases leve, moderada y grave, respectivamente) y de 12 controles sanos, de edades similares entre ambos grupos. Con este fin se ha utilizado el software denominado 2D-Pocha, escrito por los Dres. D. Adachi e Y. Ozaki (Kwansei-Gakuin University, Japan), programado sobre la base del algoritmo desarrollado de espectroscop’a de correlaci—n 2D generalizada (6).

3.ESPECTROSCOPIA INFRARROJA

El espectro s’ncrono de la regi—n infrarroja amida I se incluye en la Figura 1, en donde se advierte como autopico m‡s intenso el situado en la diagonal y centrado hacia 1633 cm-1, que es atribuible al aumento de concentraci—n de estructura b-polipept’dica a lo largo del tiempo de evoluci—n de la EA. Esta asignaci—n es consistente con la presencia del autopico hacia 1690 cm-1, que tambiŽn es caracter’stico de estructura b-polipept’dica y est‡ correlacionado positivamente con el autopico hacia 1633 cm-1. Este pico de la diagonal est‡ a su vez correlacionado negativamente con el situado hacia 1656 cm-1 que se puede asignar a estructura a-helicoidal/desordenada sobre la base de consideraciones de frecuencias de grupo y de estructura secundaria de prote’nas (10).  Esta informaci—n estructural es consistente con la generada por la regi—n entre 1350 y 990 cm-1 (Figura 2), en la que aparecen dos autopicos situados hacia 1298 y 1234 cm-1 que son atribuibles a a-hŽlices y estructura b-polipept’dica respectivamente (11) (10). Ambos picos est‡n correlacionados negativamente como indica el pico cruzado a (1298, 1234), debido al aumento de estructura b-polipept’dica y disminuci—n de a-hŽlices.

Figura 1. Espectro s’ncrono obtenido a partir de espectros infrarrojos medios en la regi—n 1710-1590 cm-1 de plasma sangu’neo de controles sanos y pacientes con EA leve, moderada y grave.

Los l’pidos son unos de los componentes del plasma m‡s susceptibles del ataque por radicales libres inductores de peroxidaci—n (12). La generaci—n de productos muy reactivos que se forman en la peroxidaci—n lip’dica puede contribuir al da–o celular y por tanto la medida de estos productos se ha usado habitualmente para evaluar el estrŽs oxidativo. Compuestos hidroxilados (por ejemplo, isoprostanos, hidroper—xidos) son productos de la peroxidaci—n lip’dica y se han descrito como marcadores de da–o oxidativo en la EA (13). La espectroscop’a infrarroja es muy sensible a la presencia de grupos hidroxilo, que se hacen visibles no solamente a travŽs de las bandas de tensi—n OH sino tambiŽn a travŽs de las de tensi—n C-O (14). La presencia de algunos restos de agua puede interferir con medidas cuantitativas de grupos hidroxilo en la regi—n de tensi—n OH a lo largo de la EA. Por tanto, una regi—n alternativa para este fin puede ser la comprendida entre 1150 y 1000 cm-1 como se muestra en la Figura 2. Un amplio autopico que abarca desde 1135 a 1000 cm-1 aproximadamente aparece en este espectro s’ncrono y es atribuible a vibraciones de tensi—n C-O. Este autopico est‡ correlacionado positivamente con el situado hacia 1234 cm-1 como consecuencia del aumento simult‡neo de concentraciones de estructura b-polipept’dica y compuestos hidroxilados derivados de la oxidaci—n lipid’dica asociada al estrŽs oxidativo presente en la EA.

Figura 2. Espectro s’ncrono obtenido a partir de espectros infrarrojos medios en la regi—n 1350-980 cm-1 de plasma sangu’neo de controles sanos y pacientes con EA leve, moderada y grave.

Los cambios de intensidad de algunas bandas infrarrojas puestos de manifiesto por espectroscop’a de correlaci—n bidimensional se han utilizado como marcadores de la EA en curvas ROC para evaluar pruebas diagn—sticas de la EA. Cl‡sicamente, la exactitud de una prueba diagn—stica se ha evaluado en funci—n de dos caracter’sticas: la sensibilidad y la especificidad. La sensibilidad de una prueba diagn—stica es la probabilidad de obtener un resultado positivo cuando el individuo tiene la enfermedad. Mide su capacidad para detectar la enfermedad cuando est‡ presente. La especificidad de una prueba indica la probabilidad de obtener un resultado negativo cuando el sujeto en cuesti—n no tiene la enfermedad. Mide su capacidad para descartar la enfermedad cuando Žsta no est‡ presente. Las curvas ROC son gr‡ficos en los que se observan todos los pares de sensibilidad/especificidad resultantes de la variaci—n continua de los puntos de corte en todo el intervalo de resultados observados. En el eje de ordenadas se sitœa la sensibilidad (S) o fracci—n de verdaderos positivos calculada en el grupo de enfermos. En el eje de abscisas se sitœa la fracci—n de falsos positivos o 1-especificidad (1 – E), calculada en el grupo no afectado por la enfermedad. Cada punto de la curva representa un par S/1-E correspondiente a un nivel de decisi—n determinado. Una prueba con discriminaci—n perfecta, sin solapamiento de resultados entre las poblaciones de sujetos sanos y enfermos, tiene una curva ROC que pasa por la esquina superior izquierda, en donde S y E toman valores m‡ximos (S y E = 1). Una prueba sin discriminaci—n, con igual distribuci—n de resultados en los dos grupos, da lugar a una l’nea diagonal de 45¼, desde la esquina inferir izquierda hasta la superior derecha. La mayor’a de las curvas ROC caen entre estos dos extremos. Cualitativamente, cuanto mayor es el ‡rea encerrada entre la curva ROC y la diagonal m‡s alta es la exactitud global del mŽtodo de diagn—stico.

Figura 3. Curva ROC obtenida mediante la intensidad del perfil espectral entre 1639 y 1624 cm-1 medida en plasma sangu’neo de controles sanos y pacientes con EA en fase leve.

La Figura 3 muestra una curva ROC obtenida mediante la intensidad del perfil espectral entre 1639 y 1624 cm-1 medida en plasma sangu’neo de 15 sujetos sanos y 12 sujetos enfermos con la EA en fase leve. El porcentaje del ‡rea comprendida entre la curva ROC y la diagonal, que indica el porcentaje de exactitud en las clasificaciones de muestras, es aproximadamente 84%. Este disminuye a 75% si en el grupo de pacientes se incluyen los de EA moderada (resultados no mostrados), lo que se puede explicar teniendo en cuenta que la formaci—n de pŽptidos b-amiloides contribuye al aumento de intensidad en esta regi—n infrarroja (11) (10), y su concentraci—n va disminuyendo al pasar a fases m‡s avanzadas (moderada, grave) de la EA (13). Por otra parte, la Figura 4 incluye una curva ROC resultante de medir la relaci—n de intensidades a 1156 y 1171 cm-1 en dos grupos de plasma sangu’neo integrados por controles sanos y pacientes con EA leve y moderada. El porcentaje de ‡rea bajo la curva ROC es de aproximadamente 80%.

4. ESPECTROSCOPIA RAMAN

Los resultados de espectrosco’a Raman de correlaci—n 2D son consistentes con los obtenidos por espectroscop’a infrarroja. La Figura 5 muestra el espectro s’ncrono obtenido a partir de espectros Raman medidos en las regiones 1725-1600 cm-1 y 1000-900 cm-1, que son caracter’sticas de la estructura secundaria de pŽptidos y prote’nas. Sobre la diagonal aparecen dos autopicos situados a 1671 y 934 cm-1 que est‡n correlacionados negativamente con el pico cruzado a (1671, 934) generado por un aumento de estructura b-polipept’dica y una disminuci—n de a-hŽlices (15) a lo largo de la EA. El mencionado cambio espectral indicativo de aumento de estructura b y la disminuci—n inherente de estructura a-helicoidal puede ser debido a la superposici—n de se–ales espectrales de diversos componentes del plasma que aparecen en el curso de la EA y que se han descrito como posibles biomarcadores de esta enfermedad.

Figura 4. Curva ROC obtenida mediante la relaci—n de intensidades 1156/1171 cm-1 medida en plasma sangu’neo de controles sanos y pacientes con EA en fase leve y moderada.

Aparte de los pŽptidos Ab40 y Ab42, en el plasma sangu’neo existen otras isoformas truncadas de pŽptidos amiloides tales como Ab37, Ab38 y  Ab39 (18). En el SNC, los pŽptidos Ab se generan en el cerebro y son transportados al sistema vascular perifŽrico a travŽs de la barrera hemato-encef‡lica (19), y tambiŽn son segregados por las plaquetas en la sangre (20). Por otra parte, una prote’na rica en estructura b-polipept’dica, la a-2-macroglobulina, se ha identificado a concentraciones elevadas en plasma sangu’neo de pacientes con la EA (4). La a-1-antitripsina se ha descrito tambiŽn como componente del plasma asociado a la EA y posible biomarcador de esta enfermedad (21). Asimismo bajo este punto de vista se pueden mencionar otras prote’nas ricas en estructura b-polipept’dica, tales como la transferrina (22) y a1-antiquimitripsina (23) (24).

As’, dos pŽptidos de 40 y 42 amino‡cidos (Ab40 y Ab42) derivados de la prote’na precursora amiloide (APP) son los dos principales componentes de las placas seniles amiloides extracelulares (16). La mayor’a de los pŽptidos Ab del plasma est‡n unidos a la albœmina, y muy pocos de estos pŽptidos est‡n en estado libre (17).

Otros cambios espectrales por debajo de 800 cm-1 se generan tambiŽn al pasar de controles sanos a pacientes afectados con la EA (5), probablemente como consecuencia de alteraciones en la estructura terciaria y aumento de concentraci—n de determinadas prote’nas en el curso de esta enfermedad.

La Figura 6 incluye una curva ROC obtenida mediante la intensidad relativa de la banda amida I a 1671 cm-1 medida en plasma sangu’neo de controles sanos y pacientes con EA en fase leve y moderada. El porcentaje de ‡rea incluida entre la curva y la diagonal es 86%, que equivale a la exactitud en la discriminaci—n entre controles y pacientes.

Figura 5. Espectro s’ncrono obtenido a partir de espectros Raman medidos en las regiones 1725-1600 cm-1 y 1000-900 cm-1 de plasma sangu’neo de controles sanos y pacientes con EA leve, moderada y grave.

Figura 6. Curva ROC obtenida mediante la intensidad relativa de la banda amida I a 1671 cm-1 medida en plasma sangu’neo de controles sanos y pacientes con EA en fase leve y moderada.

5. CONCLUSIONES

La espectroscop’a de correlaci—n 2D infrarroja y Raman puede detectar peque–os cambios espectrales que se originen en el curso de una determinada enfermedad y que representados en sus respectivas curvas ROC se puedan utilizar para el diagn—stico de la misma. Es el caso de los ejemplos anteriores referentes a la enfermedad de Alzheimer, para cuyo diagn—stico algunas regiones espectrales generan unas curvas ROC con un grado de exactitud en la clasificaci—n de muestras superior al 80%. Por tanto se satisface el criterio propuesto por el National Institute on Aging (NIA) (25) en lo que respecta a la especificidad y sensibilidad que debe tener un biomarcador ideal para el diagn—stico de la EA. No obstante se proseguir‡ dando robustez a este mŽtodo con la inclusi—n de m‡s controles sanos y pacientes afectados por la EA.

6. AGRADECIMIENTOS

Gran parte de los trabajos aqu’ mencionados han sido subvencionados con un proyecto del Plan Nacional 2009 y un proyecto INNPACTO 2012, as’ como con un Convenio/Contrato CSIC-Lab. Raman-Health.

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