ARTêCULO |
Estudio de asociaci—n epigen—mica en la pŽrdida de peso tras una intervenci—n nutricional: Estudio RESMENA
Mar’a Luisa Mansego, Marian Zulet, Javier Campi—n J, Ferm’n Milagro F, JosŽ Alfredo Mart’nez*
CIBER CB06/03 Fisiopatolog’a de la Obesidad y la Nutrici—n, (CIBEROBN), Instituto de salud Carlos III, Madrid, Espa–a y Centro de Investigaci—n en Nutrici—n y Departamento de Ciencias de la Alimentaci—n y Fisiolog’a, Universidad de Navarra. C/ Irunlarrea 1, Pamplona, Navarra 31008, Espa–a
*e-mail: jalfmtz@unav.es
Recibido el 8 de abril de 2014 An. Real Acad. Farm. Vol. 80, N¼ 3 (2014), pag.614-623
resumen
Mediante una aproximaci—n epigen—mica, se analizaron las posibles asociaciones entre los niveles basales en la metilaci—n del ADN y una mejor respuesta a la pŽrdida de peso despuŽs de un programa de intervenci—n nutricional en la poblaci—n obesa del estudio RESMENA. Esta investigaci—n ha identificado 3 regiones de ADN (genes RGS6, A2BP1 y RASGRF1) que se encuentran diferencialmente metiladas entre sujetos con alta y baja respuesta a la pŽrdida de peso. Adem‡s, estos genes est‡n implicados en la misma ruta metab—lica y hab’an sido previamente significativamente asociados con la obesidad. |
Palabras clave: Metilaci—n del ADN; intervenci—n nutricional; pŽrdida de peso.
abstract
Epigenomic association study in weight loss after a nutritional intervention: RESMENA Study
Through anepigenomics approach, the possible association between baseline levels in DNA methylation and a better weight loss response after a multidisciplinary intervention program were analyzedin obese population from RESMENA-S study. Three DNA regions that are differentially methylated (RGS6, A2BP1 and RASGRF1 genes) showed differential methylation levels at baseline between high and low responders to the multidisciplinary weight loss intervention. Moreover, these genes were implicated in the same metabolic pathway and have been previously significantly associated with obesity. |
Keywords: DNA methylation; nutritional intervention; weight loss.
1. INTRODUCci—N
La obesidad est‡ considerada como uno de los principales problemas de salud en la mayor’a de los pa’ses por su creciente incidencia en la poblaci—n y por los trastornos fisiopatol—gicos asociados (7). La obesidad comœn es el resultado de la interacci—n entre factores ambientales y de comportamiento, como la dieta y el ejercicio, con componentes genŽticos espec’ficos de cada individuo (17). As’, la predisposici—n genŽtica es un elemento importante en el desarrollo de obesidad, por lo que las variaciones genot’picas en determinados nucle—tidos (SNPs) relacionados con la obesidad son, sin duda, de gran relevancia en dicha susceptibilidad (5). Por otra parte, los procesos epigenŽticos tienen un papel clave en la regulaci—n de la expresi—n gŽnica, modulando as’ la predisposici—n gŽnica dependiente de la secuencia de nucle—tidos. En este sentido, diversas investigaciones han revelado que diversos mecanismos epigenŽticos durante las etapas perinatales (intrauterina, lactancia,É), como el estrŽs o la dieta materna, est‡n implicados en el desarrollo posterior de obesidad y que, asimismo, la dieta y otros factores ambientales que tienen lugar durante la etapa adulta tambiŽn pueden influir en la acumulaci—n de grasa a travŽs de mecanismos epigenŽticos (3). Incluso, algunas de dichas modificaciones epigenŽticas parecen ser transmitidas a la siguiente generaci—n a travŽs de los gametos, por lo que son un serio candidato a explicar una parte del imparable incremento de la prevalencia de obesidad entre ni–os y adolescentes (21). De hecho, diversos estudios apuntan hacia la importancia de las diferencias epigenŽticas entre los diferentes individuos con mayor o menor susceptibilidad al desarrollo de obesidad y otras comorbilidades asociadas o a la facilidad para la pŽrdida de peso o su mantenimiento posterior (2, 18).
Los principales procesos epigenŽticos que podr’an influir en el desarrollo de obesidad, debido a su papel en la regulaci—n de la expresi—n de genes relacionados con ella, son la metilaci—n del ADN en las islas CpG, las modificaciones covalentes en las colas de las histonas por metilaci—n, acetilaci—n o ubiquitinaci—n, y las prote’nas reguladoras que mantienen la cromatina en un estado activo (trithorax) o silencioso (polycombs) (6). Algunos autores incluyen tambiŽn los microRNAs (miRNA) como elementos de regulaci—n epigenŽtica, bien por controlar la expresi—n de importantes genes reguladores de la epigenŽtica como las acetilasas de histonas o las DNA metiltransferasas, como por el control epigenŽtico de la expresi—n de ciertos miRNAs(23).
Algunas alteraciones metab—licas asociadas con la obesidad, como la hiperglucemia y la resistencia a la insulina, as’ como la presencia de factores prometilantes en la dieta, como el ‡cido f—lico o la metionina, parecen influir de manera decisiva sobre los procesos epigenŽticos que afectan a genes relacionados con la obesidad (4). Adem‡s, estos mecanismos epigenŽticos est‡n influenciados por otros factores habitualmente asociados a la obesidad, incluyendo la inflamaci—n, a travŽs de la acci—n de citoquinas proinflamatorias como TNFα e IL-6 (27), el estrŽs oxidativo (9) y las condiciones de hipoxia que se desarrollan en el tejido adiposo obeso (26). Todas estas modificaciones pueden ser afectadas por diversos fen—menos ambientales, incluyendo numerosos factores dietŽticos, y se ha sugerido que se podr’an transmitir por un tipo de herencia epigenŽtica transgeneracional (20). En este sentido, un estudio preliminar (19) ha vinculado la obesidad en ratas alimentadas con una dieta rica en grasa durante la edad adulta con una mayor metilaci—n del promotor de la leptina. Asimismo, se ha comprobado que dicha dieta es capaz de alterar la metilaci—n de genes tan importantes como la ‡cido graso sintasa (FAS) o el gen mitocondrial NDUFB6(15).
Por lo tanto, nuestro objetivo fue investigar los posibles cambios en los patrones de metilaci—n de ADN entre los individuos que mostraron una alta o baja respuesta a un programa integral de pŽrdida de peso en obesos.
2. material y mŽtodos
Poblaci—n de estudio y dise–o experimental
El estudio de la reducci—n del s’ndrome metab—lico en Navarra-Espa–a (RESMENA-S) es una estrategia multidisciplinar basada en la crononutrici—n y la educaci—n nutricional, junto con control dietŽtico y psicol—gico, que consisti— en un ensayo aleatorizado de dise–o paralelo y prospectivo en el que participaron un total de 100 individuos. (28). El grupo RESMENA-S (n = 50) sigui— una dieta personalizada de pŽrdida de peso (restricci—n energŽtica 30%), con una distribuci—n en macronutrientes (hidratos de carbono/grasas/ prote’nas) de 40/30/30, elevada frecuencia de ingestas (7/d’a), bajo ’ndice/ carga glucŽmica y elevada capacidad antioxidante y adherencia a la dieta Mediterr‡nea (28). El grupo control (n = 50) sigui— una dieta con la misma restricci—n energŽtica y basada en la Asociaci—n Americana del Coraz—n (AHA). El estudio tuvo una duraci—n de 8 semanas bajo control dietŽtico y psicol—gico en ambos grupos. Durante un periodo adicional de 16 semanas de auto-control, los voluntarios siguieron el mismo patr—n dietŽtico pero sin ningœn asesoramiento espec’fico.
El estudio de los niveles de metilaci—n se llev— a cabo en una submuestra de 46 sujetos obesos (50% varones). Estos participantes fueron seleccionados de la muestra de poblaci—n general y eran los que tuvieron una mejor o peor respuesta a la intervenci—n de pŽrdida de peso. Se les consider— como "alta respuesta" (perder m‡s de un 5% de su peso inicial al cabo de 24 semanas de intervenci—n; n=26) y "baja respuesta" (aquellos que no lograron una pŽrdida de su peso del 5%; n=17), respectivamente.
Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito (http://www.clinicaltrials.gov; NCT01087086), el estudio fue aprobado por el ComitŽ de ƒtica de la Universidad de Navarra (065/2009) y estuvo de acuerdo con la Declaraci—n de Helsinki (revisada en Corea del Sur en 2008).
Evaluaciones antropomŽtricas y bioqu’micas
Las medidas antropomŽtricas (peso, talla, circunferencia de cintura y cadera) se llevaron a cabo con los sujetos en ropa interior. El peso corporal se midi— con una precisi—n de 0,1 kg con una Tanita SC-330, (Tanita Corp, Jap—n). La talla se estim— con un tall’metro (Seca 713 modelo, Postfach, Alemania) con una precisi—n de 1 mm. El ’ndice de masa corporal (IMC) se calcul— como el peso corporal dividido por la altura al cuadrado (kg/m2). Las circunferencias de la cintura y la cadera se midieron siguiendo protocolos validados (28). La grasa corporal total se midi— por impedancia bioelŽctrica Tanita SC-330 (TanitaCorp, Jap—n) y por absorciometr’a con rayos X de doble energ’a (DXA) (Prodigy, versi—n de software 6,0, Madison, WI) como se describi— previamente(28).
Las concentraciones sŽricas de glucosa, colesterol total, lipoprote’nas de alta densidad-colesterol (HDL-c) y triglicŽridos se midieron en un autoanalizador Pentra C-200 (HORIBA ABX, Madrid, Espa–a) con los kits espec’ficos. Las concentraciones de insulina se determinaron mediante un kit de ensayo inmunoenzim‡tico (Mercodia, Uppsala, Suecia) en un autoanalizador Triturus (Grifols SA, Barcelona, Espa–a).
Extracci—n de ADN
Muestras de sangre venosa se recogieron al inicio del estudio para la obtenci—n de ADN. El ADN gen—mico fue extra’do utilizando el kit de purificaci—n de ADN Master Purefor Blood Version II (Biotecnolog’as Epicenter, Madison, WI, EE.UU.) y se almacen— a -80¡C hasta su procesamiento.
Determinaci—n de patrones de metilaci—n de ADN
El perfil epigenŽtico del ADN gen—mico fue analizado en 48 individuos seleccionados del estudio RESMENA-S utilizando el ensayo de metilaci—n Human Methylation 450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA) conteniendo m‡s de 485.000 sitios CpGs individuales. Brevemente, 500 ng de ADN gen—mico tratado con bisulfito s—dico (EZ DNA Methylationª Kit; Epitect, Qiagen) fue amplificado, marcado, hibridado con sondas metiladas y no metiladas y escaneado de los microarrays en la plataforma HiScanSQ de Illumina, Inc. El an‡lisis de imagen y determinaci—n de la se–al de las sondas se realiz— usando el software Genome Studio, M—dulo de metilaci—n (Illumina, Inc).
Los datos de metilaci—n en un sitio CpG concreto se obtuvieron a partir de las intensidades de se–al para la sonda metilada (M) y la no metilada (U) para ADN gen—mico en esa posici—n. As’, los nivel de metilaci—n (β) fueron calculados como la proporci—n de metilado respecto al total de la se–al [i.e., β = M/(M + U)], donde el rango β oscila desde 0 (no metilado) a 1 (metilado).
El an‡lisis de las rutas metab—licas se realiz— con el uso de Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Ingenuity Systems, Inc., Redwood City, CA, EE.UU.; http://www.ingenuity.com), que incluye datos de forma manual precisos y trazables totalmente derivados de fuentes bibliogr‡ficas.
An‡lisis estad’sticos
Los an‡lisis estad’sticos se realizaron utilizando el paquete estad’stico SPSS 15.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). La prueba de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilks se utilizaron para determinar la normalidad en la distribuci—n variable.
Las diferencias en los par‡metros cl’nicos y antropomŽtricos tras la intervenci—n entre respondedores altos y bajos a la dieta fueron evaluadas con la prueba t-Student o la U de Mann Whitney. El gr‡fico de volc‡n y la diferencia entre los distintos sitios CpGs fueron evaluados por ANOVA de una v’a (respuesta al efecto de la dieta ajustado por edad y efecto del uso de distintos microarrays) gracias al programa Array Studio 5.0 (Omicsoft, Cary, NC, USA). Se aplic— la tasa de falso descubrimiento (False DiscoverRate; FDR) en los ajustes por comparaciones mœltiples.
3. resultados y discusi—n
El presente proyecto se ha centrado en la selecci—n de los individuos que participaron en el estudio RESMENA-S hasta el final del mismo. Las caracter’sticas generales de los participantes agrupados en funci—n de su respuesta a la intervenci—n dietŽtica, no difirieron significativamente entre los sujetos del grupo control y RESMENA-S en variables antropomŽtricas, presi—n arterial y perfil lip’dico (Tabla 1). Sin embargo, los individuos con una alta respuesta a la dieta mostraron una reducci—n significativa en la mayor’a de los par‡metros antropomŽtricos con respecto a sus valores iniciales de los mismos.
Con respecto a los resultados obtenidos en el microarray Human Methylation450 BeadChip, tras analizar los controles de calidad de dicho array se redujo la muestra a 46 sujetos analizados. El gr‡fico de volc‡n mostr— la distribuci—n de los 485512 sitios CpG analizados con respecto a la respuesta frente a la pŽrdida de peso debida a la dieta (Figura 1). El estudio de microarray mostr— 90 sitios CpG diferencialmente metilados (P-valor <0,01) entre sujetos con alta respuesta a la dieta frente a los que presentaron una baja respuesta a la intervenci—n nutricional. Ninguno de estos CpG fue estad’sticamente significativo tras los ajustes por comparaciones mœltiples aplicando FDR. Cuarenta de estos sitios se encontraron hipometilatos y cincuenta hipermetilados en el grupo de los sujetos con baja respuesta comparado con los que mostraron alta respuesta a la perdida de peso. Las caracter’sticas de los 10 principales genes asociados independientemente con la respuesta a la dieta (Tabla 2).
Tabla 1.- Caracter’sticas cl’nicas de 46 obesos en situaci—n basal y tras 24 semanas de intervenci—n dietŽtica de la poblaci—n RESMENA-S.
Variables |
Alta respuesta (N=28) |
Baja respuesta (N=20) |
||
Basal |
DespuŽs de 24 semanas |
Basal |
DespuŽs de 24 semanas |
|
Sexo (N mujeres, %) |
14 (48,9) |
9 (47,9) |
||
Edad (a–os) |
49,9 (10,6) |
45,6 (8,2) |
||
Tipo de dieta (N control(%)) |
11 (41,4) |
9 (47,9) |
||
Peso (kg) |
100,9 (17,6) |
90,0 (18,6) * |
105,2 (18,2) |
108,0 (17,5) |
IMC (kg/m2) |
35,9 (4,8) |
31,9 (4,9) ** |
36,9 (1,9) |
35,9 (2,0) |
Cintura (cm) |
110,9 (13,3) |
101,3 (14,9) * |
114,8 (11,9) |
114,9 (9,2) |
Cadera (cm) |
116,2 (9,3) |
109,1 (9,4) ** |
118,9 (7,1) |
116,7 (7,9) |
êndice CC |
1,0 (0,1) |
0,9 (0,1) |
1,0 (0,1) |
1,0 (0,1) |
PAS (mmHg) |
151,3 (18,1) |
131,2 (13,6)** |
145,9 (16,2) |
140,3 (14,3) |
PAD (mmHg) |
85,3 (9,8) |
75,8 (10,0) ** |
85,6 (6,4) |
81,9 (11,4) |
Masa grasa (%) |
38,1 (8,1) |
33,2 (8,0) * |
41,2 (5,5) |
37,1 (6,2) |
Glucosa (mg/dl) |
117,2 (28,1) |
104,0 (16,2) * |
133,4 (43,7) |
128,3 (34,0) |
CT (mg/dl) |
221,2 (51,1) |
213,1 (41,1) |
216,3 (50,3) |
215,2 (52,7) |
HDLc (mg/dl) |
44,2 (10,1) |
47,6 (11,2) |
41,2 (11,5) |
47,3 (15,5) |
TG (mg/dl) |
178,5 (86,5) |
123,4 (41,9)* |
220,6 (142,3) |
229,3 (163,3) |
Insulina (mUl) |
13,1 (7,5) |
6,3 (3,8) ** |
18,9 (11,3) |
16,0 (10,6) |
Media (Desviaci—n est‡ndar). IMC: êndice de Masa Corporal; êndice CC: êndice cintura/cadera; PAS: Presi—n arterial sist—lica; PAD: Presi—n arterial diast—lica; CT: Colesterol total; HDLc: lipoprote’nas de alta densidad-colesterol; TG: Trigl’ceridos. *P-valor <0.05, **P-valor <0,001 frente a los valores basales.
Con respecto a los resultados de IPA sobre rutas metab—licas implicadas para estos 90 sitios CpGs diferencialmente metilados entre los sujetos con alta y baja respuesta tras la intervenci—n, se identificaron redes relacionadas con el c‡ncer, las enfermedades del sistema reproductivo y la respuesta inflamatoria, ciclo celular, lesiones organismo, y las anomal’as y c‡ncer, y el movimiento celular, el tr‡fico de cŽlula inmune, desarrollo y funci—n del sistema hematol—gico que participan en la respuesta de la pŽrdida de peso (Figura 2).
Figura 1.- Gr‡fico tipo volc‡n de la asociaci—n de metilaci—n ajustado por edad y sexo (N=43) La l’nea discontinua muestra los genes con niveles de metilaci—n significativamente diferenciados entre sujetos con alta y baja respuesta a la dieta (p-valor < 0.01).
Tabla 2.-Caracter’sticas genŽticas de los 10 CpGs con mayor asociaci—n a la respuesta dietŽtica ajustados por edad y sexo en 43 individuos.
Gen |
ID Illumina |
Cr |
Posici—n CpG |
Media de cambio |
P-valor |
MAST4 |
cg01933079 |
5 |
65929713 |
1.174 |
5.02E-06 |
RGS6 |
cg10741333 |
14 |
72400168 |
1.0797 |
3.07E-05 |
TBC1D16 |
cg16775460 |
17 |
77984481 |
-1.0581 |
4.41E-05 |
TMEM38A |
cg04172000 |
19 |
16771088 |
-1.0879 |
5.34E-05 |
A2BP1 |
cg01050225 |
16 |
7703947 |
1.1481 |
6.34E-05 |
RASGRF1 |
cg15156078 |
15 |
79383413 |
1.0601 |
6.86E-05 |
LETMD1 |
cg01016169 |
12 |
51441443 |
-1.0777 |
6.93E-05 |
PTPRN2 |
cg25029446 |
7 |
157495282 |
1.0594 |
7.70E-05 |
NUBPL |
cg22905571 |
14 |
32269554 |
1.1076 |
7.90E-05 |
GIMAP8 |
cg01364581 |
7 |
150175800 |
1.108 |
8.80E-05 |
ID:Identificador, Cr: cromosoma. Version 37.
El reciente concepto "nutrici—n personalizada" asociado a los campos de la gen—mica, la prote—mica y la metabol—mica est‡ surgiendo con fuerza en los œltimos tiempos (16). En ese sentido, los estudios gen—micos se est‡n dirigiendo hacia la prevenci—n de la obesidad bas‡ndose en dietas personalizadas (22). En consecuencia, los marcadores genŽticos y epigenŽticos han sido considerados como herramientas de predicci—n para evaluar las diferencias individuales en la capacidad de respuesta despuŽs de una intervenci—n nutricional (12). Nuestro an‡lisis revel— que el patr—n de la metilaci—n epigenŽtica diferencial entre sujetos con alta y baja respuesta a un programa de pŽrdida de peso multidisciplinario podr’a ayudar a predecir la disminuci—n de peso en obesos adultos.
Figura 2.- Ruta metab—lica cuyas funciones principales son la se–alizaci—n y morfolog’a celular y compuesta por 6 de los genes con mayor asociaci—n a la respuesta de la dieta (RGS6, PTPRN2, MAST4, RASGRF1, GIMAP8, NUBPL).
Adicionalmente, se han identificado algunos genes con una clara influencia sobre la obesidad como es el caso del gen A2BP1 (cg01050225), que codifica para la prote’na 1 de uni—n a ataxina-2 (tambiŽn conocido como Fox-1) y puede estar implicado en transcripci—n alternativa de tejidos espec’ficos (11). Adem‡s, este gen contiene motivos de uni—n a ARN, A2BP1 tambiŽn interactœa con la ataxina-2 (ATXN2) (24), una prote’na que parece ser que participan en el metabolismo de ARN (14). ATXN2 ha sido relacionada en la enfermedad neurodegenerativa, ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2) (14), y la hiperfagia y la obesidad son dos caracter’sticas cl’nicas principales en SCA2 (1). Consistente con esta observaci—n, se ha descrito como ratones knockout para ATXN2 (Sca-/ -) presentan mayores valores de IMC que rat—n tipo salvaje para este gen cuando ambos son alimentados con una dieta alta en grasas (10, 13).
Otro de los genes asociados a la respuesta dietŽtica es el RGS6 que a su vez se ha descrito como gen candidato para el estudio de la adiposidad, ya que pueden estar asociados con una tendencia conductual hacia el consumo de alimentos cargado de grasa (25).
Por œltimo, una asociaci—n entre la metilaci—n gŽnica del gen RASGRF1 al inicio del estudio y los cambios antropomŽtricos despuŽs de la intervenci—n. Los sujetos que respondieron eficazmente al tratamiento mostraron porcentajes de metilaci—n significativamente m‡s altos despuŽs del tratamiento.RASGRF1 est‡ implicado en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa mediante la regulaci—n de las cŽlulas beta pancre‡ticas (8). Ratones knock-out para el gen RASGRF1 muestran un fenotipo similar a las manifestaciones de tipo 2 de diabetes precl’nica (8).
En resumen, este trabajo describe un patr—n epigenŽtico diferencial en sujetos de la poblaci—n RESMENAS que podr’a ser aplicado para predecir cambios de peso corporal. TambiŽn se ha identificado 90 regiones de ADN diferencialmente metiladas, dependiendo de la respuesta de la pŽrdida de peso. Estos cambios epigenŽticos pueden ayudar a entender y predecir mejor la respuesta para perder peso.
4. agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por L’nea Especial sobre Nutrici—n, Obesidad y Salud (Universidad de Navarra LE/97), la fundaci—n Mapfre y CIBER CB06/03 Fisiopatolog’a de la Obesidad y la Nutrici—n, (CIBEROBN), Instituto de salud Carlos III. A M.L.M. se le fue concedida una beca Juan de la Cierva del Ministerio de Econom’a y Competitividad del gobierno de Espa–a.
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