ARTêCULO

Detecci—n de alŽrgenos de cacahuete mediante un sensor de ADN

Marta S‡nchez-Paniagua L—pez1, Gloria Frutos Cabanillas2, M. Jesœs Lobo Casta–—n3, Beatriz L—pez-Ruiz1*

1Sec. Dptal. Qu’mica Anal’tica, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, 28040, Madrid, Espa–a. 2Dpto. Estad’stica e Investigaci—n Operativa, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, 28040, Madrid, Espa–a. 3Dpto. Qu’mica F’sica y Anal’tica, Facultad de Qu’mica, Universidad de Oviedo, 33006, Oviedo, Espa–a

*e-mail: bealopru@ucm.es


                                                                                                           An. Real Acad. Farm. Vol. 80, N¼ 2 (2014), pag. 377-392.

resumen

En el presente trabajo se propone un genosensor electroqu’mico para la detecci—n de un segmento de ADN que codifica parte de la prote’na alergŽnica Ara h 2 del cacahuete. El genosensor se basa en un ensayo tipo s‡ndwich, el analito hibrida con dos secuencias de bases, una de ellas inmovilizada sobre un electrodo de oro serigrafiado, formando una monocapa autoensamblada. La optimizaci—n del dispositivo se realiz— utilizando la metodolog’a de Superficies de Respuesta. La m‡xima respuesta se encontr— para concentraciones de sonda de captura y agente bloqueante, 1 mM y 2,5 mM respectivamente.

Palabras clave: cacahuete; sensor de ADN electroqu’mico; Superficies de respuesta.

abstract

Detection of peanut allergens by a DNA sensor

In the present work an electrochemical genosensor for detecting a DNA segment encoding part of the allergenic protein peanut Ara h 2 is proposed. Genosensors is based on a sandwich assay format, the analyte hybridized with two base sequences, one immobilized onto a screen printed gold electrode, forming a self-assembled monolayer. The optimization of the device was performed using Response Surface Methodology. The maximum response was found to be 1 µM of capture probe concentration and 2,5 mM of blocking agent concentration.

Keywords: peanut; electrochemical DNA sensor; response surface metodology.

1. INTRODUCci—N

La incidencia de las alergias alimentarias y la gravedad de sus consecuencias han incrementado el interŽs de los consumidores y ha pasado a ser una cuesti—n de seguridad alimentaria y salud pœblica. Se estima que en Europa las alergias alimentarias afectan aproximadamente al 1-2 % de la poblaci—n adulta y al 5-7 % de la poblaci—n infantil, aumentando su incidencia en los œltimos a–os. Se hace indispensable tomar medidas para proteger a la poblaci—n sensible, informando adecuadamente sobre los ingredientes alergŽnicos que contienen los alimentos e identificando posibles contaminaciones cruzadas. Por ello, se han establecido normas de etiquetado que obligan a indicar su presencia. La legislaci—n alimentaria espa–ola, en sentido estricto, no regula los alŽrgenos, lo que hace es fijar obligaciones en cuanto a la informaci—n en el etiquetado sobre estos ingredientes alŽrgenos. Existe una lista de 14 grupos de ingredientes alergŽnicos, entre los que se encuentra el cacahuete y los productos a base de cacahuetes, que es obligado declarar en el etiquetado de los productos alimenticios con independencia del porcentaje en peso que representen en el producto final. Real Decreto 1334/1999, de 31 de julio, por el que se aprueba la Norma general de etiquetado, presentaci—n y publicidad de los productos alimenticios en Espa–a y Reglamento N¼ 1169/2011 del Parlamento Europeo y del Consejo de 25 de Octubre de 2011 sobre la informaci—n alimentaria facilitada al consumidor. Entre esos 14 grupos se encuentra el cacahuete y productos a base de cacahuetes. El cacahuete Arachis hypogaea, conocido tambiŽn como man’ y perteneciente a la familia de las Papilion‡ceas (leguminosas), es un alimento muy alergŽnico de gran importancia sanitaria por la incidencia y severidad de la reacci—n alŽrgica que produce. En los pa’ses desarrollados afecta a un 0,4%-0,6% de los ni–os y un 0,3%-0,7% de los adultos. En Espa–a, la prevalencia de esta alergia est‡ aumentando, probablemente debido a la mayor popularidad de los productos derivados del cacahuete y a su inclusi—n en las dietas infantiles.

Algunas de las prote’nas de almacenamiento del cacahuete son las responsables de la reacci—n alŽrgica. Aproximadamente, el 20% del contenido total proteico del cacahuete se puede atribuir al alŽrgeno principal Ara h 1 y el 10% al alŽrgeno Ara h 2. Estos dos alŽrgenos son la causa del 95% de las reacciones alŽrgicas de esta legumbre (1). La sensibilizaci—n al cacahuete ocurre generalmente durante la infancia y con frecuencia persiste a lo largo de la vida; en este sentido, difiere de otras alergias alimentarias frecuentes (como la alergia a las prote’nas de la leche o del huevo), que surgen en la infancia pero generalmente desaparecen en la vida adulta.

Aunque no se conoce con certeza el nivel umbral necesario para causar la reacci—n alŽrgica, hay estudios que demuestran que cantidades de prote’na del orden de microgramos son suficientes para originar reacciones objetivas en sujetos hipersensibles (2). Por lo tanto, la presencia, no declarada, de trazas de cacahuete en los alimentos puede ser muy peligrosa para estos individuos. Bock y col. realizaron un estudio de 32 casos de muerte por anafilaxia debidas a la ingesti—n de alimentos alergŽnicos. Encontraron que m‡s de la mitad de los accidentes mortales (55-67%) se debieron a la ingesti—n de cacahuete y que en el 90% de los casos, los alŽrgenos responsables fueron los cacahuetes y las nueces (3). Adem‡s de los numerosos productos alimenticios industriales que incluyen cacahuetes como galletas, chocolate, aperitivos, cereales, es habitual encontrarse con alimentos que contienen este alŽrgeno cuyo origen es la contaminaci—n cruzada producida durante el procesamiento. Por ello, resulta necesario disponer de mŽtodos adecuados de an‡lisis para la detecci—n de alŽrgenos de cacahuete en productos alimenticios. Se han desarrollado mœltiples mŽtodos anal’ticos basados en la detecci—n de dos tipos de macromolŽculas, prote’nas y ADN: los primeros detectan alguna de las prote’nas alergŽnicas del cacahuete, mientras que los segundos se basan en la detecci—n de secuencias de oligonucle—tidos que codifican alguna de dichas prote’nas alergŽnicas. Los mŽtodos m‡s utilizados para la detecci—n de prote’nas son los enzimoinmunoensayos y, en especial, el mŽtodo ELISA (4-6). Aunque este ensayo ha demostrado ser sensible y vers‡til, consume tiempo y es relativamente caro, adem‡s, los procesos de producci—n implican un tratamiento tŽrmico que, a menudo, desnaturaliza las prote’nas de los alimentos, alterando de este modo su estructura terciaria e impidiendo su detecci—n. Teniendo en cuenta que el ADN no se altera tras someterse a altas temperaturas, los mŽtodos basados en la detecci—n de ADN surgen como una interesante alternativa. Dentro de estos mŽtodos, el primero en aparecer y m‡s utilizado hasta el momento es la reacci—n en cadena de la polimerasa, PCR, cuantitativa (7-9), mŽtodo muy sensible que requiere equipos caros y personal cualificado. Estos inconvenientes han impulsado el desarrollo de otros mŽtodos anal’ticos entre los que se encuentran los biosensores de ADN o genosensores, que presentan ventajas como su menor coste, facilidad de manejo, posibilidad de automatizaci—n, etc. En la revisi—n bibliogr‡fica realizada solo se ha encontrado un genosensor electroqu’mico aplicado a la detecci—n de alŽrgenos de cacahuete, basado en la detecci—n del ADN que codifica parte del alŽrgeno Ara h 1 (10).

En el presente trabajo se propone un genosensor electroqu’mico para la detecci—n del ADN que codifica parte de la prote’na alergŽnica Ara h 2. Se opt— por un formato tipo s‡ndwich en el que todo el analito hidrida con dos secuencias complementarias, una inmovilizada sobre un electrodo de oro serigrafiado y la segunda funcionalizada con biotina. La optimizaci—n del dispositivo se llev— a cabo mediante dise–os de experimentos (DoE), metodolog’a que ha demostrado ser una potente herramienta en qu’mica anal’tica y, especialmente, en la optimizaci—n de dispositivos anal’ticos, aunque su uso no est‡ muy extendido en el campo de los biosensores (11-13).

La metodolog’a de dise–os de experimentos es una herramienta matem‡tica y estad’stica cuyos objetivos son seleccionar la estrategia experimental —ptima que permita obtener la m‡xima informaci—n con el m’nimo coste y evaluar los resultados experimentales obtenidos, garantizando la m‡xima fiabilidad. Los DoE ofrecen ventajas incuestionables frente a la metodolog’a cl‡sica, entre las que cabe destacar: i) estima el error experimental, ii) calcula la influencia simult‡nea de los factores, iii) calcula el efecto de las interacciones, iv) con el mismo nœmero de experimentos proporciona mayor informaci—n, y v) supone un ahorro de tiempo y esfuerzo as’ como un menor coste econ—mico (14).

Existen gran variedad de dise–os de experimentos (15). Una forma de clasificarlos es en funci—n del objetivo anal’tico propuesto, diferenci‡ndose entre dise–os de cribado o ÒscreeningÓ y dise–os de optimizaci—n. En los dise–os screening el objetivo es reducir el posible nœmero de factores experimentales que afectan a la respuesta, descartando los que tienen menor o ninguna influencia en la misma. Estos dise–os son adecuados en la fase inicial de experimentaci—n y entre los m‡s utilizados se encuentran los Dise–os Plackett-Burman y Dise–os Factoriales a dos niveles. Existen dos tipos de dise–os factoriales, completos y fraccionados. En los dise–os factoriales completos se utilizan todas las combinaciones posibles de todos los factores a todos los niveles implicados en el experimento, habr‡ Lk combinaciones de L niveles de k factores. Los dise–os factoriales fraccionados est‡n formados por una fracci—n del correspondiente dise–o factorial completo y contemplan un nœmero menor de experimentos. Una vez realizado el cribado de las variables, se procede a la optimizaci—n de la respuesta, para lo cual se utilizan dise–os factoriales a tres o m‡s niveles, Dise–os Centrales compuestos, Dise–os Box-Behnken, Dise–os Doehlert y Dise–os D-—ptimos entre otros, que aportan informaci—n relacionada con el efecto cuantitativo de los factores as’ como sus interacciones y permiten obtener la Superficie de Respuesta para la variable dependiente en el espacio de las variables independientes.

2. material y mŽtodos

2.1. Reactivos

El 6-mercapto-1-hexanol (MCH), ditiotreitol (DTT), fosfatasa alcalina-estreptavidina (ALP-Strp), 1-naftilfosfato, albœmina humana (BSA), tween 20, las sales para la preparaci—n de las disoluciones tamp—n (Tris, KCl, MgCl2) y la disoluci—n 20× de fosfato de sodio salino con EDTA pH 7.4 (200 mM fosfato s—dico, 3 M NaCl, 20 mM EDTA) fueron suministrados por Sigma-Aldrich (Espa–a) y utilizados sin purificaci—n previa. El etanol y el ‡cido sulfœrico fueron adquiridos en Panreac (Espa–a).

Las disoluciones tamp—n utilizadas en la preparaci—n del sensor fueron: i) disoluci—ntamp—n de inmovilizaci—n e hibridaci—n formada por 2×SSPE pH 7,4; ii) disoluci—ntamp—n de bloqueo consistente en 5×SSPE pH 7,4 + 5% BSA + 0,1% Tween 20; y iii) disoluci—ntamp—n de medida compuesta por 0,5 M Tris-HCl pH 9,8 + 1 mM de MgCl2 + 0,1 M de KCl.

Las secuencias de oligonucle—tidos utilizadas fueron suministradas por Sigma-Life Science (Reino Unido). Dichas disoluciones se reconstituyeron en agua Milli-Q y se almacenaron a -20¼C hasta su uso.

2.2. Instrumentaci—n

Las medidas electroqu’micas se realizaron en un potenciostato Autolab PGSTAT 12, controlado por el software GPES 4.9005 (EcoChemie B.V, Holanda). Se utilizaron electrodos serigrafiados de oro (referencia 220BT; DropSens, Espa–a) que constan de una configuraci—n de tres electrodos impresos en una l‡mina de alœmina, un electrodo de trabajo (di‡metro 4 mm) y un electrodo auxiliar, ambos de oro, y un electrodo de pseudo-referencia de plata. La celda electroqu’mica est‡ limitada por un anillo formado por un pol’mero aislante que rodea a los tres electrodos y tiene un volumen m‡ximo de 50 mL. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente utiliz‡ndose un electrodo para cada medida. Las medidas de pH se realizaron en un pH-metro Crison micropH 2001 (Espa–a). Para la cuantificaci—n del ADN se utiliz— un espectrofot—metro UV-visible Cary 300 Bio (Agilent Tehcnologies, Estados Unidos).

2.3. Procedimiento experimental

2.3.1. Dise–o del sensor de ADN

Como todos los biosensores, los genosensores o sensores de ADN combinan un elemento de reconocimiento biol—gico, que en este caso es una secuencia de oligonucle—tidos denominada sonda, con un transductor encargado de la medida de la reacci—n de hibridaci—n entre la sonda y el analito. La sonda utilizada ser‡ complementaria a la secuencia de ADN de interŽs (analito) y formar‡n un h’brido de Watson-Crick con extrema selectividad incluso en presencia de sondas de oligonucle—tidos no complementarias.

La preparaci—n del sensor comienza por la formaci—n de una monocapa autoensamblada (SAM) sobre la superficie del electrodo de oro. Antes de su utilizaci—n, los electrodos serigrafiados de oro se sometieron a un proceso de limpieza que consisti— en lavado con etanol y agua Milli-Q seguido de un pretratamiento electroqu’mico de 25 barridos c’clicos entre 0 y +1,6V, a 100 mV/s, en H2SO4 0,1 M, para eliminar los residuos del proceso de fabricaci—n, y as’ mejorar la sensibilidad y reproducibilidad de los resultados (16).

La monocapa mixta (SAM), consta de una sonda de ADN tiolada y como agente bloqueante, mercaptohexanol (MCH). La inmovilizaci—n de la sonda se llev— a cabo mediante un proceso de quimisorci—n, uni—n colavente entre los grupos SH de la sonda con el Au del electrodo. El MCH se intercala entre las hebras de ADN quimisorbidas, controlando su disposici—n sobre el electrodo e impidiendo las adsorciones inespec’ficas de la sonda. Las cadenas de ADN se orientan paralelas entre s’ y perpendiculares a la superficie electr—dica (Figura 1), y as’, favorecen el proceso de hibridaci—n (17, 18).

Figura 1.- Formaci—n de una monocapa autoensamblada mixta organizada sobre electrodos de oro serigrafiado.

Para la inmovilizaci—n de la sonda de captura se depositaron 15 µL de una disoluci—n de la sonda en el tamp—n de inmovilizaci—n, manteniŽndose en atm—sfera cerrada y saturada con agua durante 19 horas. La monocapa mixta se complet— adicionando 10 µL de MCH en disoluci—n tamp—n de inmovilizaci—n; dej‡ndose 15 min. Las concentraciones de sonda de captura y MCH cambian y se especifican en cada una de las experiencias.

El genosensor propuesto se basa en un formato tipo s‡ndwich que requiere la hibridaci—n completa del analito con dos sondas diferentes. Una parte de la secuencia del analito hibrida con una sonda indicadora biotinilada (hibridaci—n homogŽnea, Figura 2.A) y el resto de analito hibrida con la sonda de captura inmovilizada (hibridaci—n heterogŽnea, Figura 2.B). La hibridaci—n homogŽnea se llev— a cabo mezclando el analito y la sonda indicadora en la disoluci—n tamp—n de hibridaci—n, con una concentraci—n de sonda indicadora final de 2 µM. La mezcla se calent— a 98¼C para romper las estructuras secundarias de ambas sondas, se sumergi— en hielo y se dej— reposar a temperatura ambiente para favorecer la hibridaci—n. Posteriormente, se depositaron 15 µL de esta disoluci—n sobre el electrodo modificado, dejando que transcurriese la hibridaci—n heterogŽnea durante 2 horas a temperatura ambiente.

 Figura 2.- Etapa de hibridaci—n. (A) Hibridaci—n homogŽnea o en disoluci—n e (B) hibridaci—n heterogŽnea o en superficie

Concluida la etapa de hibridaci—n, se procedi— al marcaje enzim‡tico, a–adiendo 15 µL de una disoluci—n del conjugado fosfatasa alcalina-estreptavidina (1,075×10-3 g/L) sobre la monocapa. La sonda indicadora biotinilada se uni— al conjugado enzim‡tico por el enlace de alta afinidad estreptavidina-biotina. Finalmente, se llev— a cabo la detecci—n electroqu’mica para lo cual se a–adi—, a la superficie electr—dica, 40 µL de una disoluci—n de 1-naftilfosfato 4 mM en disoluci—n tamp—n de medida. El enzima ALP cataliza la conversi—n de 1-naftilfosfato a 1-naftol, producto electroactivo de estructura plana heteroc’clica, cuya oxidaci—n se midi— mediante voltamperometr’a de pulso diferencial (DPV), realizando un barrido de 0 a +0,6 V.

2.3.2. Dise–o de experimentos

Se realiz— un dise–o factorial completo 32, con 2 variables (concentraciones de sonda de captura y MCH) medidas a 3 niveles. Los resultados se analizaron con el software estad’stico Statgraphics¨ Centurion, versi—n XVI (19). El modelo que puede soportar el dise–o utilizado es la funci—n polin—mica de segundo grado:

donde los coeficientes b representan los efectos lineales y cuadr‡ticos de las variables X1 (concentraci—n de sonda de captura, M) y X2 (concentraci—n de MCH, M) as’ como su interacci—n. La variable dependiente o variable respuesta es la respuesta electroqu’mica medida por el genosensor (intensidad de corriente, A).

En general, los dise–os de experimentos se escriben en tŽrminos de variables codificadas. En un dise–o a tres niveles, como es este caso, los niveles de los factores codificados son +1, 0 y -1, donde +1 es el valor m‡ximo considerado, -1 el valor m’nimo y 0 el valor central. En la Tabla 1 se muestra la matriz codificada y la matriz experimental y los niveles experimentales fijados para cada uno de los factores estudiados.

Tabla 1. - Matriz codificada y matriz experimental del Dise–o Factorial 32

Matriz codificada

Matriz experimental

Niveles del factor 1

Niveles del factor 2

Concentraci—n de la sonda de captura (µM)

Concentraci—n de MCH (mM)

0

-1

1,05

0,5

0

0

1,05

2,5

+1

+1

2

4,5

0

0

1,05

2,5

0

+1

1,05

4,5

-1

+1

0,1

4,5

-1

-1

0,1

0,5

+1

-1

2

0,5

0

0

1,05

2,5

0

0

1,05

2,5

El dise–o propuesto se realiz—, en el mismo instrumento, el mismo d’a y por el mismo operador, es decir, en condiciones de repetibilidad. La aleatoriedad en el orden de realizaci—n de los experimentos asegura, en la medida de lo posible, que factores incontrolados no afecten de forman sistem‡tica a los resultados obtenidos y se asegura que las estimaciones de la varianza en la repetibilidad reflejen de manera adecuada los aspectos aleatorios del proceso.

3. resultados y discusi—n

3.1. Selecci—n de las sondas de oligonucle—tidos

Para obtener un sensor œtil desde el punto de vista anal’tico, el fragmento de oligonucle—tidos elegido como analito tiene que cumplir como m’nimo las siguientes caracter’sticas: i) ser espec’fico del cacahuete y ii) no tratarse de una secuencia de ADN muy larga (no m‡s de 100 nucle—tidos) para evitar la aparici—n de estructuras secundarias y apareamientos de bases que dificultar’an la hibridaci—n (20).

Como analito se seleccion— una secuencia de 86-mer que codifica parte de la prote’na Ara h 2, caracter’stica del cacahuete y cuya especificidad se comprob— mediante el programa BLAST (21).

Se seleccion— una sonda de captura de 32 bases tiolada en el extremo 5«, complementaria en su totalidad con parte del analito y una sonda indicadora de 54 nucle—tidos funcionalizada en su extremo 3Õ con biotina. La sonda de captura se dise–— de forma que hibride con la parte del analito que queda libre en la hibridaci—n con la sonda indicadora, formando las tres hebras un dœplex perfecto. De esta forma, se evita que alguna base quede sin hibridar y dŽ lugar a adsorciones inespec’ficas sobre el electrodo y por tanto a errores en la medida.

Para predecir las posibles estructuras secundarias de las sondas y la energ’a de hibridaci—n del analito con la sonda de captura e indicadora se utiliz— el programa inform‡tico Mfold web Server (22). La estructura secundaria de la sonda de captura presenta una energ’a libre DG= -2,9 kcal/mol, la del analito ΔG = -16,71 kcal/mol, la de la sonda indicadora ΔG = -4,39 kcal/mol, el h’brido analito-sonda de captura presenta una energ’a libre ÆG = -49,8 kcal/mol y el h’brido analito-sonda indicadora ÆG = -85,5 kal/mol. Estos datos demuestran la hibridaci—n espont‡nea del analito con las dos sondas.

3.2. Selecci—n de las caracter’sticas del dise–o de experimentos

En la ejecuci—n de un dise–o de experimentos resulta de gran importancia identificar adecuadamente los factores o variables independientes que pueden afectar a la respuesta (variable dependiente) as’ como sus niveles experimentales. Una selecci—n err—nea de estos niveles podr’a dar lugar a respuestas muy similares que no se deber’an a la no influencia del factor sobre la respuesta sino simplemente a que el factor no afecta en la zona de trabajo, pero puede hacerlo si se ampl’a dicha zona.

Se comenz— por optimizar la composici—n de la monocapa, considerando como factores las concentraciones de sonda de captura y de mercaptohexanol. Al seleccionar los niveles, hay que intentar conseguir una SAM homogŽnea y no demasiado compacta de forma que se permita el contacto entre las hebras complementarias (23).

Experiencias previas demostraron que una concentraci—n de sonda de captura inferior a 0,1 µM produc’a defectos en la monocapa quedando zonas de oro no cubiertas. Por otra parte, se requiere un exceso de sonda de captura en relaci—n al h’brido analito-sonda indicadora con el fin de asegurar que todo el analito incorporado va a poder reaccionar con la sonda de captura para formar el h’brido final. Teniendo esto en cuenta se consideraron como l’mites experimentales 0,1 y 2 µM.

Estudios previos aportan evidencias de que aunque el tratamiento posterior con MCH no permite eliminar completamente el ADN adsorbido inespec’ficamente, se logra una disminuci—n considerable de las interacciones inespec’ficas y una eficiencia de hibridaci—n superior a la de una SAM pura de ‡cido nucleico tiolado (24). Con el objetivo de minimizar las absorciones inespec’ficas de la sonda de captura sobre la superficie electr—dica, en todos los casos se a–adi— mayor cantidad de MCH que de sonda de captura. Valores de MCH inferiores a 0,5 mM produc’an descensos dr‡sticos en la se–al voltamperomŽtrica del 1-naftol, gener‡ndose probablemente una monocapa irregular. Se comprob— que concentraciones superiores a 4,5 mM provocaban el desplazamiento de la sonda de captura. Como consecuencia se seleccionaron como valores l’mites 0,5 y 4,5 mM.

3.3. Ensayo preliminar

Antes de realizar los dise–os de experimentos se llev— a cabo un estudio previo con el fin de comprobar que las sondas de captura e indicadora hibridan, de forma selectiva, con el analito y que ese evento de hibridaci—n se traduce en una se–al electroqu’mica. Se opt— por valores de concentraci—n de sonda de captura y MCH utilizados con Žxito en trabajos anteriores (16), 2 µM y 4,5 mM respectivamente. El resto de condiciones experimentales fueron las descritas en el Procedimiento Experimental. En la Figura 3 se muestra el voltamperograma obtenido con el analito y con una secuencia no complementaria (nC), ambas a un nivel de concentraci—n 1 nM. El analito dio una se–al muy superior al blanco mientras que la se–al generada por la sonda no complementaria fue semejante a la generada por el blanco, lo que demuestra la complementariedad de las sondas con el analito y la especificidad del dispositivo.

 

Figura 3.- Voltamperogramas obtenidos con la secuencia analito, una secuencia no complementaria y un blanco. Condiciones experimentales: Voltametr’a diferencial de impulsos, amplitud de pulso 20 mV, velocidad de barrido 10 mV/s.

3.4. Optimizaci—n de la monocapa

Con el objetivo de optimizar la composici—n de la monocapa se realizaron dos dise–os factoriales completos 32, ya descritos en el apartado Dise–o estad’stico, siendo las variables independientes las concentraciones de sonda de captura y de MCH. En el primero de ellos se utiliz— una concentraci—n de analito de 10 nM. El diagrama de Pareto (Figura 4.A) muestra la influencia de las variables y sus interacciones en la respuesta del sensor, siendo el efecto cuadr‡tico de ambas variables el de mayor influencia en la respuesta. El efecto individual de las variables muestra una influencia menor, siendo positivo el efecto del MCH y negativo el efecto de la sonda de captura. El modelo matem‡tico obtenido corresponde a la funci—n

Sanalito (A) = 5,22737×10-6 + 4,98504×10-6[sonda captura] + 5,97693×10-6[MCH] - 4,50416×10-6[sonda captura]2 + 1,54737×10-6[sonda captura][MCH] - 1,4×10-6[MCH]2

La Figura 4.B muestra los efectos principales sobre la intensidad de corriente producidos por las dos variables. En la Figura 4.C se muestra la superficie de respuesta y en la Figura 4.D las correspondientes curvas de nivel proyectadas en el plano formado por los dos factores. Estas curvas de nivel muestran las condiciones experimentales para las que se obtiene el valor m‡ximo de respuesta as’ como un espacio pr—ximo al —ptimo con la misma respuesta para distintas condiciones experimentales, pudiendo elegir de toda la zona los valores de los factores m‡s convenientes segœn otros criterios econ—micos de tipo coste, tiempo, etc. Este m‡ximo viene definido por los valores —ptimos de los factores implicados que resultaron ser 1μM de sonda de captura y 2,5 mM de MCH.

Figura 4.- Resultados del dise–o factorial 32 con analito 10 nM, (A) diagrama de Pareto estandarizado para intensidad de corriente, (B) gr‡fica de efectos principales para la intensidad, (C) superficie de respuesta y (D) curvas de nivel.

Debido a la complejidad de la monocapa es habitual la aparici—n de adsorciones inespec’ficas de las sondas y los agentes que la componen y que se traduce en se–ales indeseables. Para averiguar la posible existencia de estas adsorciones y su efecto en la se–al, se realiz— un segundo dise–o con una disoluci—n blanco. La matriz experimental y los niveles de los factores del dise–o factorial 32 fueron los mismos que en el dise–o anterior. Segœn el diagrama de Pareto (Figura 5.A), el MCH fue el factor de mayor influencia, siendo Žsta negativa al igual que la sonda de captura, es decir, el blanco dio menor se–al al aumentar el contenido de sonda y agente bloqueante. Este hecho se atribuye a la formaci—n, bajo estas condiciones, de una monocapa compacta y sin huecos que dificultan las adsorciones inespec’ficas. El modelo matem‡tico ajustado corresponde a la funci—n

Sblanco (A) = 8,43393×10-7 - 1,48473×10-7[sonda captura] - 2,19162×10-7[MCH] - 1,19114×10-8 [sonda captura]2 + 3,32895×10-8 [sonda captura][MCH]+ 2,3625×10-8[MCH]2

La Figura 5.B muestra los efectos principales sobre la intensidad de corriente producidos por las dos variables, no estableciŽndose un valor m’nimo de respuesta para la sonda de captura en la zona de experimentaci—n. As’ mismo, la superficie de respuesta (Figura 5.C) no presenta un —ptimo y las curvas de nivel de este ensayo (Figura 5.D) muestran una tendencia que apunta hacia la posibilidad de modificar el campo experimental hacia valores mayores de sonda de captura, sin embargo, mayores concentraciones de sonda de captura dificultar’an la reacci—n de hibridaci—n por impedimento estŽrico.

Figura 5.- Resultados del dise–o factorial 32 con un blanco (A) diagrama de Pareto estandarizado para intensidad de corriente, (B) gr‡fica de efectos principales para la intensidad, (C) superficie de respuesta y (D) curvas de nivel.

Con el objetivo de conocer la se–al debida exclusivamente al analito, se gener— una nueva variable diferencia (se–al del analito – se–al del blanco). El modelo matem‡tico obtenido corresponde a la ecuaci—n

Sanalito-Sblanco (A) =4,39816×10-6 + 5,13019×10-6 [sonda captura] + 6,17592×10-6 [MCH] - 4,49307×10-6 [sonda captura]2 + 1,51579×10-6 [sonda captura][MCH] - 1,42×10-6 [MCH]2

En la Figura 6 se muestran la superficie de respuesta para el analito, el blanco y la diferencia y la curva de nivel para la diferencia en la Figura 6.D. Los valores —ptimos pr‡cticamente coincidieron con los obtenidos previamente, 1μM de sonda de captura y 2,5 mM de MCH, ya que la se–al obtenida por el blanco, en estas condiciones, es pr‡cticamente despreciable frente a la obtenida con el analito. Reducir los valores del blanco es uno de los principales objetivos en estos dispositivos anal’ticos, para as’ aumentar la relaci—n se–al/blanco y, como consiguiente, el l’mite de detecci—n. Los blancos obtenidos en estas condiciones experimentales hacen que la relaci—n S/B aumente de manera apreciable.

Figura 6.- Curvas de superficie de respuesta: (A) 10 nM de analito, (B) blanco y (C) diferencia 10 nM analito-blanco. (D) Curva de nivel para la variable diferencia.

3.5. Curva de calibrado y estudio de reproducibilidad

Se realiz— una curva de calibrado, bajo las condiciones experimentales —ptimas obtenidas de los dise–os de experimentos, 1µM de sonda de captura y 2,5 mM de MCH. Se observ— una relaci—n lineal entre la intensidad de corriente y la concentraci—n de analito, con un intervalo lineal de 1×10-10 a 1 10-7 M (Figura7), una ecuaci—n I (A) = 2×10-6 C (nM) + 4×10-6, y un coeficiente de regresi—n: r=0,998. El l’mite de detecci—n result— ser 50 pM. Para la reproducibilidad se midi— la respuesta de una disoluci—n de analito 10 nM en ocho electrodos diferentes, el coeficiente de variaci—n obtenido fue 7,56 % (n = 8).

Figura 7.- Curva de calibrado obtenida bajo las condiciones —ptimas: 1µM de sonda de captura, 2,5 mM de MCH, 2 µM de sonda de indicadora, 1,075×10-3 g/L conjugado ALP-Strp y 4 mM naftilfosfato. Inlet: Intervalo lineal.

4. Conclusiones

Las sondas indicadora y de captura seleccionadas hibridan de manera selectiva con el analito, y el sensor de ADN electroqu’mico resultante permiti— la determinaci—n selectiva de una secuencia espec’fica de Ara h 2, prote’na alergŽnica del cacahuete. Mediante el uso de dise–os experimentales factoriales 32 se obtuvieron superficies de respuesta a partir de las cuales se calcularon los valores —ptimos de los factores considerados en la optimizaci—n de la monocapa autoensamblada, 1µM de sonda de captura y 2,5 mM de mercaptohexanol. El genosensor propuesto presenta una relaci—n lineal entre la respuesta anal’tica y la concentraci—n de analito en un amplio intervalo concentraciones, entre 0,1 nM y 0,1 μM, con un l’mite de detecci—n del orden de picomolar y una reproducibilidad satisfactoria, que lo hace id—neo para su utilizaci—n como detector del alŽrgeno Ara h 2.

5. agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero obtenido a travŽs del Proyecto Nacional financiado por el Ministerio de Econom’a y Competitividad. C—digo: MINECO-13-CTQ2012-31157 y del Grupo de Investigaci—n Universidad Complutense (Ref. Grupo: 950247).

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