ARTêCULO |
1FES-Zaragoza, Universidad Nacional Aut—noma de MŽxico (UNAM). 2Departamento de Farmacia y Tecnolog’a FarmacŽutica. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid (UCM)
*e-mail: megil@ucm.es, tcvaldes05@yahoo.com.mx
Recibido el 3 de junio de 2013 -An. Real Acad. Farm. Vol. 80, N¼ 1 (2014), p‡g. 179-191
RESUMEN
Los nanotransportadores de f‡rmacos son una excelente opci—n para formar sistemas farmacŽuticos eficientes y seguros. Interleucina 2 (IL-2) es eficaz en la terapia antitumoral, sin embargo su administraci—n sistŽmica se ha limitado por su alta toxicidad. En el presente trabajo se aborda la investigaci—n en animales del tratamiento antitumoral con IL-2 transportada en liposomas frente a IL-2 libre, y se aborda un paso imprescindible para el futuro uso de los liposomas con IL-2 como terapia biotecnol—gica para pacientes con carcinoma de cŽrvix: los primeros estudios de estabilidad farmacŽutica. |
Palabras clave: Interleucina 2; Liposomas; Estabilidad.
aBSTRACT
Drug nanosystems are an excellent option to form efficient and safe pharmaceutical systems. Our team has developed methodology based on the use of Interleukin 2 (IL-2) which has proven very effective in antitumor therapy, but systemic administration is limited by its high toxicity. The present work discusses in vivo evaluation of the tumor using IL-2 carried in liposomes against IL-2 free, and also addresses an important and necessary step for the future use of IL-2 liposomes in biotechnology therapy for patients with carcinoma of the cervix: the early pharmaceutical stability studies. |
Keywords: Interleukin 2; Liposomes; Stability.
1. introducCIîn
Los liposomas son nanotransportadores constituidos por bicapas concŽntricas de l’pidos anfip‡ticos separadas por un compartimiento acuoso. Los liposomas se forman cuando los l’pidos anfip‡ticos se dispersan en agua y las partes hidrof—bicas de estas molŽculas se acomodan en bicapas para liberarse del agua, dejando compartimientos acuosos en el interior y exterior. En la parte acuosa se pueden transportar diversas molŽculas hidrof’licas de diferente naturaleza como ‡cidos nucleicos, f‡rmacos inorg‡nicos, citocinas, ant’genos o anticuerpos. Si el material que se desea transportar son molŽculas hidrof—bicas, estas pueden ser incluidas dentro de las bicapas lip’dicas del liposoma. Es importante mencionar que el nœmero de bicapas lip’dicas concŽntricas, la composici—n de l’pidos, la carga elŽctrica de estos y la v’a de administraci—n pueden ser variadas para favorecer que los liposomas lleguen al lugar del organismo deseado (—rgano, tejido, cŽlulaÉ).
Las sustancias encapsuladas en liposomas pueden ser administradas in vivo por diferentes v’as de acuerdo a la diana deseada. Existe la posibilidad de llegar al sitio deseado modificando a los liposomas para no ser ingeridos por los macr—fagos; sin embargo, si la diana son los macr—fagos, existe una muy alta probabilidad de que las sustancias encapsuladas en liposomas entren en ellos y modifiquen su funci—n. Con este enfoque, se ha avanzado mucho en la vehiculizaci—n de f‡rmacos optimizando la v’a de administraci—n y la dosis necesaria. De hecho, los liposomas se han convertido en herramientas de gran utilidad, debido a que garantizan que peque–as concentraciones de cualquier sustancia lleguen al blanco adecuado reduciendo la toxicidad o efectos colaterales causados por el paso de las sustancias por el torrente sangu’neo. En la actualidad estas part’culas han sido ampliamente utilizadas en una diversidad de aplicaciones; tales como veh’culos para la transfecci—n de material genŽtico, liberadores de f‡rmacos en sitios espec’ficos y como modelos de diferentes tipos de membranas biol—gicas normales y transformadas (1).
Nuestro grupo de trabajo empez— utilizando liposomas para activar exitosamente a macr—fagos con diferentes citocinas y evaluando la viabilidad tecnol—gica de este modelo utilizando la curva S de Gompertz (2). Posteriormente, se investig— in vivo la posibilidad de usar estos nanotransportadores para la liberaci—n de una citocina inmunorreguladora, evitando que los liposomas pudieran ser fagocitados. Consecuencia de estos trabajos, se ha elegido, caracterizado y patentado (3-4) una formulaci—n de liposomas que no es reconocida por los macr—fagos y que adem‡s es capaz de transportar una molŽcula inmunorreguladora muy eficaz: el factor estimulador de linfocitos llamado Interleucina 2 (IL-2).
La IL-2 ha sido aprobada por la FDA como f‡rmaco efectivo para la terapia de tumores humanos por su activaci—n del sistema inmunol—gico, en particular de los linfocitos T citot—xicos y de las cŽlulas asesinas (5). Sin embargo, su administraci—n v’a sistŽmica se ha limitado debido a su alta toxicidad (6). Por esta raz—n se han buscado diversos mŽtodos para liberar IL-2 a los tumores in situ, tal es el caso del uso de diversos tipos de liposomas (7); adem‡s estas part’culas se han dise–ado buscando su afinidad a las membranas de las cŽlulas tumorales (8), ya sea llevando la IL-2 en su interior o unida covalentemente al exterior buscando su uni—n a las cŽlulas diana (9-11).
Recientemente se ha descrito que diversas cŽlulas tumorales poseen receptores funcionales para IL-2 (IL-2R), lo que ha convertido a este receptor en un blanco potencial para inmunoterapia (12). En este sentido, nuestro equipo ha informado de la presencia del receptor funcional para IL-2 en diversas l’neas tumorales de c‡ncer cŽrvico-uterino provenientes de pacientes mexicanas (13); as’ como del uso de nanotransportadores con IL-2 para la reducci—n de tumores de cŽlulas humanas inducidos en ratones (14).
Los buenos resultados obtenidos en estos estudios han llevado al equipo a abordar un proyecto internacional con el objetivo final de alcanzar una terapia biotecnol—gica para pacientes con carcinoma de cerviz uterino, mediante la investigaci—n y el desarrollo de un medicamento basado en liposomas con IL-2.
En el presente trabajo se aborda la investigaci—n en animales del tratamiento antitumoral de IL-2 transportada en liposomas frente a IL-2 libre. Para ello, se emplean los liposomas con IL-2 dise–ados y desarrollados por el equipo y se evalœa su capacidad para vectorizar a tumores de c‡ncer cŽrvico-uterino por la presencia del receptor funcional para IL-2 en los mismos.
En el presente trabajo tambiŽn se aborda un paso importante y necesario para el uso futuro de nuestro sistema nanotransportador como terapia biotecnol—gica para pacientes con carcinoma de cŽrvix: los primeros estudios de estabilidad farmacŽutica con fines de preformulaci—n del medicamento biotecnol—gico.
2. materiales y mŽtodos
2.1. Preparaci—n de liposomas con IL-2
Los liposomas transportadores de IL-2 objeto del trabajo son liposomas cati—nicos, fabricados utilizando Espermidil-Colesterol (Esp-CH), un l’pido cati—nico que aunque es sintŽtico, sus componentes est‡n presentes en la naturaleza y se ha comprobado que no es citot—xico (15).
Para la preparaci—n de los liposomas cati—nicos se us— una mezcla que conten’a el l’pido cati—nico Espermidil-Colesterol (Esp-CH) (sintetizado por el Dr. Miguel Ib‡–ez, MŽxico DF) y Fosfatidilcolina (PC) (Sigma Chemical, USA) usando una relaci—n molar 1:1. La mezcla de l’pidos (10µmol) fue disuelta en cloroformo, el disolvente fue evaporado utilizando un flujo de nitr—geno a presi—n reducida, los liposomas se formaron por la hidrataci—n de la pel’cula de l’pidos en soluci—n amortiguadora de fosfatos (PBS) (liposomas vac’os) o con IL-2 (R&D Systems, USA) (100 UI/mL) en PBS (liposomas con IL-2) mediante tres ciclos de sonicaci—n (sonicador Lab Supply G112SOI) de 5 segundos separados por per’odos de descanso de 30 segundos. Los liposomas formados fueron lavados por sedimentaci—n a 200.000g durante 40 minutos en PBS, y despuŽs fueron resuspendidos en PBS.
2.2 Aspecto de los liposomas con IL-2: Microscop’a electr—nica
Para determinar la morfolog’a y tama–o de nuestro sistema transportador se recurri— a la microscop’a electr—nica. Los liposomas con IL-2 se colocaron en rejillas de cobre con 200 mallas que estaban cubiertas con Formvar, se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y despuŽs se elimin— el l’quido por decantaci—n con papel filtro. Posteriormente, las muestras se ti–eron con una soluci—n acuosa de acetato de uranilo al 4% durante 5 minutos, se elimin— el exceso de l’quido y se dejaron secar durante 24 horas.
2.3. Evaluaci—n in vivo, en animales de experimentaci—n
2.3.1. Animales de experimentaci—n
Se utilizaron ratones hembra de la cepa CBA/ca de 18 a 24 meses de edad. Se mantuvieron en cajas especiales con ambiente controlado (esterilidad y 21¼C), en grupos de cuatro, y se les suministr— alimento y agua ad libitum, segœn los protocolos aprobados por la Comisi—n de ƒtica para animales de experimentaci—n de la UNAM (Universidad Nacional Aut—noma de MŽxico), la cual cumple con los c—digos para el cuidado y uso de animales de experimentaci—n.
2.3.2. Inducci—n de tumores en ratones
Para el modelo de inducci—n de tumores y evaluaci—n del efecto biol—gico de los liposomas con IL-2 obtenidos se utiliz— la tŽcnica desarrollada por Rangel et al. (14). Brevemente, se utilizaron ratones singŽnicos de la cepa CBA, se inmunodeprimieron utilizando hidrocortisona, se les inyectaron las cŽlulas tumorales de la l’nea INBL, se continu— la inmunodepresi—n en un tiempo total de seis semanas. Asumiendo que cada tumor es similar a una esfera, se calcul— la masa tumoral de cada uno con la f—rmula 4/3 ¹r3 y se sum— la masa tumoral total. Adem‡s se evaluaron los efectos adversos visibles generados por la masa tumoral.
2.3.3. Evaluaci—n del efecto de los liposomas con IL-2 sobre el tama–o de la masa tumoral.
Una vez inducidos los tumores en los ratones y determinado su tama–o inicial, se establecieron 3 grupos:
-grupo control
-grupo tratado con IL-2
-grupo tratado con liposomas transportadores de IL-2
El tratamiento se aplic— diariamente, durante 5 d’as, despuŽs de los cuales se sacrific— a los animales y se realiz— una inspecci—n minuciosa. Se cuantificaron los tumores, se extrajeron y se calcul— la masa tumoral total.
2.3.4. Evaluaci—n del efecto protector de los liposomas con IL-2 frente a los posibles efectos adversos causados por IL-2 libre (no transportada)
Se emplean los mismos grupos de ratones del estudio anterior. DespuŽs de sacrificarles, se realiza una inspecci—n minuciosa para evaluar los posibles efectos adversos visibles derivados del tumor (grupo control), del tratamiento con IL-2 libre y del tratamiento con IL-2 transportado en liposomas.
2.3.5. Evaluaci—n del efecto de los liposomas con IL-2 sobre las cŽlulas tumorales.
Para la observaci—n de los posibles cambios morfol—gicos de las cŽlulas de los tumores inducidos en los ratones, debido al tratamiento con liposomas con IL-2, se sacrificaron, lotes de ratones despuŽs de una y dos horas de la administraci—n de los liposomas con IL-2. Los tumores extra’dos de los ratones sacrificados fueron fijados con glutaraldeh’do al 2.5% durante 1 hora y postfijados con soluci—n Osmio-Milloning al 1% durante 1 hora. Las muestras fueron deshidratadas y embebidas en Epon¨ para proceder a cortar secciones finas de los tumores que se colocan en rejillas de cobre recubiertas con Formvar y se contrastan con citrato de plomo para su evaluaci—n por microscop’a electr—nica de transmisi—n (microscopio electr—nico JEOL-JEM-1010, JEOL USA, Inc., MA, USA).
2.4 Estudios de estabilidad f’sica de los liposomas en el marco de la preformulaci—n del medicamento biotecnol—gico.
Para la evaluaci—n de la estabilidad f’sica de los liposomas, se procedi— a realizar la medici—n inicial de su tama–o y su complejidad en el cit—metro de flujo (16), para despuŽs analizar sus posibles cambios f’sicos debidos a la exposici—n a diferentes causas de inestabilidad durante un determinado periodo de tiempo.
Los cambios en el tama–o y la complejidad de los liposomas se determinaron mediante la evaluaci—n de las diferencias entre los histogramas obtenidos en la citometr’a para el tama–o y la conformaci—n de los liposomas reciŽn preparados y tras el almacenamiento. Se utiliz— la estad’stica de Kolmogorov-Smirnove (K-S), de forma que, un valor de D (Diferencia) de 0 indicar’a un total solapamiento y por tanto una total igualdad de los histogramas, y un valor de 1 indicar’a que ningœn punto est‡ en concordancia, por lo que los histogramas ser’an totalmente diferentes. Para establecer la existencia de una diferencia significativa en el tama–o o complejidad de los liposomas, el valor de D debe ser mayor a 0,5.
2.4.1. Fotosensibilidad
El estudio de fotoestabilidad se llev— a cabo siguiendo normativa ICH (17). Se tomaron muestras cada 15 minutos durante 45 minutos, a fin de detectar si se produc’an cambios significativos en conformaci—n y tama–o de los liposomas, mediante citometr’a de flujo.
2.4.2. Efecto del pH
Con la finalidad de determinar el efecto del pH del medio sobre la estabilidad del sistema farmacŽutico, se colocaron diferentes muestras en diferentes soluciones acuosas amortiguadoras con un intervalo de valores de pH comprendido entre 4 y 10. Las muestras se evaluaron despuŽs de una hora por citometr’a de flujo para detectar si se produc’an cambios significativos en la conformaci—n y tama–o de los liposomas.
2.4.3. Efecto de la temperatura
A fin de observar el efecto de la temperatura sobre el sistema farmacŽutico, los liposomas fueron sometidos a 3 temperaturas diferentes, en estufas de estabilidad estandarizadas (18), realizando un muestreo semanal durante un periodo de 5 semanas, para su evaluaci—n por comparaci—n con las especificaciones iniciales de complejidad y tama–o.
3. RESULTADOS Y DISCUSIîN
3.1. Aspecto de los liposomas con IL-2: Microscop’a electr—nica.
La tinci—n negativa del sistema nanotransportador observada al microscopio electr—nico (Figura 1) muestra liposomas con tama–os comprendidos entre 30 y 80 nm.
Figura 1.- Fotograf’a de los liposomas IL-2 (microscopio electr—nico).
3.2. Inducci—n de tumores en ratones
Se inyectaron cŽlulas de la l’nea INBL a un grupo de ratones inmunodeprimidos y despuŽs de 20 d’as fueron sacrificados, encontrando masas tumorales con una suma total en promedio de 20 mm3. Por tanto, se establece que 20 d’as es el tiempo suficiente para tener un modelo animal de utilidad para la evaluaci—n in vivo del tratamiento biotecnol—gico basado en los liposomas con IL-2.
Este modelo ser‡ de utilidad para la evaluaci—n de la estabilidad biol—gica del medicamento biotecnol—gico basado en los liposomas con IL-2.
3.3. Evaluaci—n in vivo del efecto de los liposomas con IL-2 sobre el tama–o de la masa tumoral.
Los resultados obtenidos en los tres grupos de ratones (grupo control, grupo tratado con IL-2 libre y grupo tratado con IL-2 transportada en los liposomas) indican un promedio de masa tumoral total de 20,5 mm3 para los ratones control, 2 mm3 para los tratados con IL-2 en el sistema nanotransportador y 3 mm3 para los tratados con IL-2 libre. La total ausencia de tumores en algunos ratones y el peque–o tama–o de los existentes en otros ratones indican el fuerte efecto de la IL-2 ya sea libre o transportada en liposomas.
Cabe se–alar que aunque la IL-2 libre es igualmente eficiente que la IL-2 nanotransportada para la reducci—n del crecimiento tumoral, los efectos adversos causados por la citocina libre, como son la inflamaci—n y el goteo capilar, no se observan en los ratones tratados con la citocina transportada en los liposomas (Figura 2).
Figura 2.- Comparaci—n de efectos adversos usando: Veh’culo (a), IL-2 libre (b) y encapsulada en liposomas (c).
3.5. Evaluaci—n del efecto de los liposomas con IL-2 sobre las cŽlulas tumorales.
Para evaluar los posibles cambios en los tumores despuŽs de administrarles los liposomas con IL-2, se extrajeron tumores una y dos horas despuŽs del tratamiento. Se procedi— a fijarlos, postfijarlos, deshidratarlos, incluirlos en resina, cortarlos, contrastarlos y observarlos con un microscopio electr—nico. Los resultados indican la posible presencia de los liposomas en la masa tumoral (Figuras 3 y 4).
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Figuras 3 y 4.- Microscop’a electr—nica de tumores. Microfotograf’as que muestran la posible presencia de nuestras part’culas dentro de los tumores tratados.
Es necesario destacar que tan s—lo una hora despuŽs de la administraci—n de los liposomas con IL-2, las cŽlulas tumorales empiezan a sufrir da–os severos perdiendo la integridad de sus membranas (Figuras 5 y 6).
Figura 5.- Microscop’a electr—nica de tumores. Microfotograf’a que muestra una cŽlula tumoral no tratada con liposomas con IL-2.
Figura 6.- Microscop’a electr—nica de tumores. Microfotograf’a que muestra una cŽlula tumoral tratada con liposomas con IL-2.
3.6. Estudios de estabilidad f’sica de los liposomas en el marco de la preformulaci—n del medicamento biotecnol—gico.
La estabilidad f’sica de los liposomas se evalu— determinando por citometr’a de flujo su tama–o y complejidad iniciales, de tal forma que se tenga un referente para comparar los posibles cambios en tama–o, debido al posible reacomodo de las bicapas, al hinchamiento/lisis, y comparar los posibles cambios de complejidad debidos a la conglomeraci—n de las part’culas.
Los resultados de comparaci—n de histogramas obtenidos indican que el sistema farmacŽutico no es sensible a la luz (Figura 7), que existe solo un pH de m‡xima estabilidad (Figura 8) y que existen dos temperaturas de m‡xima estabilidad (Figura 9). Cabe aclarar que no se mencionan los valores de pH y de temperatura de m‡xima estabilidad porque la estabilidad y la formulaci—n de los liposomas con IL-2 dise–ados y desarrollados por el equipo de investigaci—n se encuentran en fase de desarrollo tecnol—gico para la obtenci—n de la patente de formulaci—n.
Este modelo de evaluaci—n de la estabilidad f’sica de los liposomas con IL-2 ser‡ de utilidad para la evaluaci—n de la compatibilidad de dichos liposomas con sus posibles veh’culos, constituyentes del medicamento biotecnol—gico final.
Figura 7.- Estudio de fotoestabilidad: comparaci—n de histogramas tras 45 minutos de exposici—n. A) Complejidad (SSC-A), B) Tama–o (FSC-A). Se realiz— la sobreposici—n del histograma control (azul) y el histograma de cada condici—n (negro) y se realizo la prueba estad’stica K –S para establecer que no existen diferencias significativas.
Figura 8.- Comparaci—n de histogramas para el œnico pH que no mostr— diferencia significativa con la conformaci—n inicial. A) Complejidad (SSC-A), B) Tama–o (FSC-A). Se realizo la sobreposici—n del histograma control (azul) y el histograma de cada condici—n (negro) y se realizo la prueba estad’stica K –S para establecer que no existen diferencias significativas.
Figura 9.- Comparaci—n de histogramas para dos temperaturas que no mostraron diferencia significativa con la conformaci—n inicial. A) Complejidad (SSC-A), B) Tama–o (FSC-A). Se realizo la sobreposici—n del histograma control (azul) y el histograma de cada condici—n (negro) y se realizo la prueba estad’stica K –S para establecer que no existen diferencias significativas.
4. CONCLUSIONES
Recientemente, diferentes part’culas liposomales han sido dise–adas a fin de transportar molŽculas con actividad biol—gica. IL-2 es un potente estimulador inmune que podr’a ser liberado en el sitio tumoral por liposomas con el fin de ayudar al organismo a montar una respuesta inmune antitumoral mediante la activaci—n de cŽlulas asesinas.
Los linfocitos presentan receptores para la IL-2 y es mediante esta citocina que se activan a cŽlulas citot—xicas o asesinas, por lo que se esperar’a que la IL-2 trasportada por los liposomas los active convirtiŽndolos en cŽlulas asesinas. De esta manera se podr’an dise–ar estrategias para que estos vectores liposomales puedan transportar las dosis necesarias de la molŽcula de IL-2 in situ y tener una posible actividad terapŽutica, sin los fuertes efectos t—xicos que se producen en el organismo cuando IL-2 libre es administrada a las dosis necesarias para un efecto terapŽutico v’a sistŽmica.
La l’nea celular de c‡ncer cŽrvico uterino INBL tiene la caracter’stica particular de expresar el receptor para IL-2 como los linfocitos y cŽlulas NK. La raz—n por la cual estas cŽlulas epiteliales expresan un receptor t’pico de linfocitos es desconocida; sin embargo, creemos que representa una oportunidad para intervenci—n en la respuesta inmune. La raz—n de construir liposomas que puedan presentar molŽculas de IL-2 en su superficie es no solo para favorecer que se unan a cŽlulas del sistema inmunol—gico que tienen un receptor para este factor, sino que tambiŽn esperar’amos que puedan servir como un puente de uni—n simult‡nea a las cŽlulas tumorales ya que tambiŽn presentan el receptor y de est‡ forma al tener a las cŽlulas inmunocompetentes y a las tumorales en cercana proximidad se podr’a promover la activaci—n del sistema inmune contra el tumor (Figura 10).
Figura 10.- Representaci—n gr‡fica del posible puente entre el liposoma, la cŽlula tumoral y una cŽlula del sistema inmune.
Se esperar’a que la uni—n entre las cŽlulas tumorales y los linfocitos promovida por los liposomas que expresan IL-2 en su superficie externa pueda contribuir a favorecer el reconocimiento de posibles ant’genos tumorales y a la activaci—n de cŽlulas citot—xicas especificas. En este trabajo presentamos evidencias de que los liposomas son capaces de reducir alrededor del 90% el crecimiento tumoral en un modelo de inducci—n de tumores en ratones.
Adem‡s nuestros resultados de estabilidad f’sica y el modelo para la evaluaci—n de la estabilidad biol—gica nos ser‡n de gran utilidad para la evaluaci—n de la compatibilidad de los liposomas IL-2 con sus posibles veh’culos, necesaria como paso previo a las pruebas de fase precl’nica en humanos. En este momento, los resultados de estabilidad para preformulaci—n de los liposomas IL-2 nos indican que tenemos dos temperaturas y un pH de m‡xima estabilidad que son ideales para su formulaci—n en diferentes veh’culos farmacŽuticos, los cuales ser‡n patentados en breve.
5. AGRADECIMIENTOS
Direcci—n General de Asuntos del Personal AcadŽmico (DGAPA) de la UNAM, proyectos PAPIIT 220108 y 222108 y por el proyecto ICyT PIUTE 10-100.
6. REFERENCIAS
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