ARTêCULO

Regulaci—n de la neurotransmisi—n glicinŽrgica en procesos de dolor inflamatorio: una nueva v’a de acci—n de la prostaglandina E2 en mŽdula espinal

Jaime de Juan-Sanz, Enrique Nœ–ez, Beatriz L—pez-Corcuera, Carmen Arag—n

Departamento de Biolog’a Molecular, Centro de Biolog’a Molecular ÔÔSevero OchoaÕÕ (CSIC-UAM), Universidad Aut—noma de Madrid, Madrid, Espa–a. Centro de Investigaci—n BiomŽdica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), ISCIII, Madrid, Espa–a. Instituto de investigaci—n Hospital Universitario La Paz (IdiPAZ), Madrid, Espa–a.

e-mail: jdejuan@cbm.uam.es


Premio Abell— del Concurso Cient’fico 2012 de la Real Academia Nacional de Farmacia. An. Real Acad. Farm. Vol 79, N¼ 3 (2013), pag. 434-449.

RESUMEN

La acci—n de la glicina como neurotransmisor inhibidor es finalizada por su recaptaci—n del espacio sin‡ptico a travŽs de dos transportadores espec’ficos, GlyT1 (isoforma glial) y GlyT2 (isoforma neuronal). En este trabajo describimos un mecanismo mediante el cual la uni—n de la prostaglandina E2 (un importante mediador del dolor inflamatorio) a sus receptores EP3 activa la recaptaci—n de glicina llevada a cabo por GlyT2. Esta activaci—n coincide con una disminuci—n de la ubiquitinaci—n del transportador, modificaci—n post-traduccional necesaria para su correcto tr‡fico intracelular. Una menor ubiquitinaci—n de GlyT2 produce una acumulaci—n del transportador en la superficie neuronal, lo que explica la activaci—n observada. Por tanto, los resultados de este trabajo sugieren que GlyT2 es una interesante diana terapŽutica cuya inhibici—n podr’a contribuir a la reducci—n del dolor inflamatorio.

Palabras clave: Neurotransmisi—n glicinŽrgica, Prostaglandina E2, Ubiquitinaci—n.

ABSTRACT

Regulation of the glycinergic neurotransmission during inflammatory pain: A new pathway in the action of Prostaglandin E2 in the spinal cord

Glycinergic inhibitory neurotransmission is terminated by reuptake through specific transporters, GlyT1 (glial isoform) and GlyT2 (neuronal isoform). In this work we describe that Prostaglandin E2 (PGE2, an important mediator of inflammatory pain) activates GlyT2-mediated recapture of glycine via interaction with the EP3 receptor. Moreover, in these conditions a diminished ubiquitination of GlyT2 is observed. Ubiquitination is an important modification for the correct trafficking of this transporter. We propose that the reduction of ubiquitination leads to accumulate GlyT2 in the neuronal surface, which could explain the PGE2-mediated activation of GlyT2. Therefore, our results suggest that GlyT2 is an interesting therapeutic target and its inhibition could contribute to reduce inflammatory pain.

Keywords: Glycinergic neurotransmission, Prostaglandin E2, Ubiquitination.

1. introducCIîn

Las v’as aferentes sensitivas tienen la capacidad de transmitir al cerebro sensaci—n de dolor en respuesta a est’mulos que potencialmente pueden producir da–os en los tejidos del cuerpo. Estas v’as, llamadas v’as nociceptivas, se componen de fibras nerviosas que poseen un di‡metro reducido, est‡n frecuentemente demielinizadas y conectan los tejidos perifŽricos con el sistema nervioso central (SNC). En el tejido perifŽrico se encuentran las terminaciones de las neuronas nociceptoras, que se pueden activar al recibir un est’mulo potencialmente da–ino generando un potencial de membrana que es transmitido a lo largo de la neurona hasta llegar a las astas dorsales de la mŽdula espinal. Ah’ se forman contactos sin‡pticos locales con interneuronas excitadoras e inhibidoras, y con proyecciones neuronales provenientes de las ‡reas superiores del SNC mediante las cuales se transmite la informaci—n al cerebro. Esta red de contactos locales en la mŽdula es un primer punto de control de la transmisi—n del dolor, pudiendo favorecer o no la propagaci—n de este. Es lo que se ha denominado Compuerta Espinal en la teor’a de la Compuerta o Puerta de Entrada propuesta por Melzack y Wall en 1965 (1).

Las interneuronas inhibidoras que forman estos contactos locales en la Compuerta Espinal utilizan dos tipos de neurotransmisores: el ‡cido gamma-aminobut’rico (GABA) y la glicina. De los dos, la glicina se ha propuesto como el principal neurotransmisor inhibidor en ‡reas caudales del SNC, estando muy implicada en el procesamiento de la informaci—n sensorial (2). As’, el mecanismo de acci—n de la glicina en la mŽdula espinal se lleva a cabo mediante la liberaci—n del neurotransmisor al espacio sin‡ptico y la posterior uni—n a su receptor, GlyR, en la postsinapsis, produciendo la entrada de iones cloruro que inhiben la posible excitaci—n de la neurona postsin‡ptica. Esta inhibici—n es finalizada gracias a la recaptaci—n de la glicina del espacio sin‡ptico por dos transportadores espec’ficos, GlyT1 (isoforma glial) y GlyT2 (isoforma neuronal) (3). GlyT2 tiene adem‡s la funci—n de recapturar glicina hacia el terminal presin‡ptico para facilitar su reincorporaci—n de nuevo a ves’culas sin‡pticas, ayudando a preservar su contenido cu‡ntico y permitiendo de este modo su reutilizaci—n (4).

Este tipo de neurotransmisi—n inhibidora es regulada por procesos de ubiquitinaci—n, un mecanismo por el cual se adiciona una o varias molŽculas de ubiquitina a una prote’na modificando su endocitosis, compartimentalizaci—n o degradaci—n, siendo un proceso que globalmente puede regular importantes funciones celulares (5). De este modo, se ha demostrado que la ubiquitinaci—n puede modificar la neurotransmisi—n glicinŽrgica regulando el tr‡fico del receptor de glicina GlyR (6) y de los transportadores espec’ficos GlyT1 (7) y GlyT2 (8). En estos œltimos se ha demostrado que se produce una ubiquitinaci—n espec’fica de la œltima lisina del extremo carboxilo terminal (posici—n 619 para GlyT1, posici—n 791 para GlyT2) tras la activaci—n de prote’na kinasa C (PKC) por Žsteres de forbol, como es el phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Esto induce la endocitosis de ambos transportadores, produciŽndose por tanto una disminuci—n de su funci—n.

Otra caracter’stica que ha sido relacionada con la neurotransmisi—n glicinŽrgica es la transmisi—n de dolor. En este sentido, se han encontrado durante los œltimos 10 a–os mœltiples evidencias que relacionan situaciones de dolor inflamatorio con una disminuci—n en la funci—n de la neurotransmisi—n glicinŽrgica. As’, se ha confirmado que durante el dolor inflamatorio: 1) existe una apoptosis espec’fica de interneuronas GABAŽrgicas y glicinŽrgicas (9-11); 2) en las neuronas que reciben terminales glicinŽrgicos se produce un aumento en la concentraci—n intracelular de cloruro por inhibici—n del canal KCC-2 (mediada por la presencia de BDNF) (12, 13); y 3) existe una disminuci—n de la neurotransmisi—n glicinŽrgica por la liberaci—n de la prostaglandina E2 (PGE2) (14).

Las prostaglandinas est‡n ampliamente implicadas en procesos de dolor. Son molŽculas derivadas del ‡cido araquid—nico (AA) que es liberado gracias a la activaci—n de la fosfolipasa A2 durante procesos inflamatorios. El AA es transformado en los precursores de prostaglandinas PGG2 y PGH2 por las enzimas ciclooxigenasa 1 (COX-1, expresada constitutivamente) y ciclooxigenasa 2 (COX-2, de expresi—n inducible). As’, la inhibici—n farmacol—gica espec’fica de COX-1 es utilizada a diario (con aspirina y f‡rmacos relacionados) como un mŽtodo analgŽsico que limita la producci—n de prostanoides.

En concreto, la producci—n y presencia de la Prostaglandina E2 (PGE2), que actœa a travŽs de los receptores EP (EP1-4), se ha demostrado como un efector esencial del dolor inflamatorio mediante la generaci—n de ratones deficientes en la principal enzima responsable de su s’ntesis, la Prostaglandina E Sintasa I microsomal (mPGE1). Los ratones mPGE1 (-/-) presentan niveles altamente reducidos de PGE2 junto a una menor inflamaci—n y una respuesta claramente reducida en tests de dolor (15-17). PGE2 favorece por tanto la transmisi—n del dolor inflamatorio, y uno de los principales mecanismos responsables es la inhibici—n que produce sobre la neurotransmisi—n glicinŽrgica inhibidora a nivel medular. La raz—n de esta inhibici—n parece deberse a las modificaciones que la presencia de PGE2 produce sobre el receptor de glicina (GlyR). En concreto, se ha descrito una disminuci—n de la actividad de la subunidad GlyRa3 del receptor de glicina expresada en las capas m‡s superficiales del asta dorsal de la mŽdula espinal (18). As’, la PGE2 producida por mPGE1 activa a los receptores espec’ficos EP2, que est‡n acoplados a prote’nas G estimuladoras (Gs) y producen un aumento del AMP c’clico (AMPc) intracelular. Esto desencadena la activaci—n de la prote’na kinasa A (PKA) que fosforila los receptores de glicina en la serina 346 de la subunidad GlyRa3, produciendo la inhibici—n del receptor y por tanto disminuyendo considerablemente la inhibici—n mediada por glicina (18-20).

En este trabajo proponemos un nuevo mecanismo mediante el cual PGE2 regula la neurotransmisi—n glicinŽrgica. As’, nuestros resultados demuestran una activaci—n del transportador presin‡ptico GlyT2 en presencia de PGE2 en sinaptosomas de tallo cerebral y mŽdula espinal de rata de una manera dependiente del tiempo. Adem‡s, el uso de agonistas y compuestos farmacol—gicos selectivos sugiere la implicaci—n de los receptores espec’ficos EP3 en la transducci—n de esta se–al. As’, el transporte de GlyT2 en presencia de Sulprostona (agonista de EP3, y en menor medida de EP1) y Beraprost (agonista de EP3) se activa de una manera similar a la activaci—n producida por PGE2, mientras que Butaprost (agonista de EP2) o TCS250 (agonista de EP4) no producen variaciones. Adem‡s, nuestros resultados sugieren una activaci—n de GlyT2 mediada por su desubiquitinaci—n, una modificaci—n implicada en su tr‡fico intracelular (8), que lo har’a m‡s estable en la membrana evitando su endocitosis y degradaci—n, y aumentando el nœmero de molŽculas activas presentes en la superficie celular, lo que se traduce en una recaptaci—n acelerada del neurotransmisor, y por tanto una disminuci—n en la neurotransmisi—n glicinŽrgica. De esta manera, PGE2 aparece como un regulador que actœa de forma coordinada sobre las neuronas presin‡pticas y postsin‡pticas implicadas en la neurotransmisi—n glicinŽrgica, produciendo una inhibici—n de la acci—n de la glicina en la mŽdula que facilita y promueve la transmisi—n del dolor hacia ‡reas superiores del SNC.

2. MATERIAL Y MƒTODOS

Las ratas tipo Wistar fueron mantenidas en condiciones est‡ndar en el Centro de Biolog’a Molecular Severo Ochoa, siguiendo las pautas actuales en el uso de animales en la investigaci—n en Neurociencia. La glicina tritiada ([3H]-glicina) se obtuvo en PerkinElmer Life Sciences y NFPS (inhibidor de GlyT1) y ALX-1393 (inhibidor de GlyT2) fueron adquiridos en Sigma-Aldrich. PGE2 y TCS250 se obtuvieron de Tocris Biosciencie mientras que Beraprost, Butaprost y Sulprostona se obtuvieron de Cayman Chemical, de donde provienen tambiŽn los anticuerpos espec’ficos anti-EP1, EP2, EP3 y EP4. El anticuerpo para calnexina fue de Stressgen, anti-multi Ubiquitina unido a agarosa se obtuvo de MBL international y el anticuerpo anti GlyT2 fue producido en el laboratorio (3).

2. 1. Electroforesis y Western Blot

Tras medir la concentraci—n de prote’nas en las distintas muestras por el mŽtodo de Bradford, estas fueron sometidas a electroforesis en un gel de SDS-PAGE utilizando geles concentrador (4%) y separador (7,5%). Las muestras fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa por electrotransferencia semiseca (Life Technologies, Inc.; 1,2 mA.cm-2 1 h), se bloquearon con leche 5% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con los distintos anticuerpos de interŽs a las concentraciones indicadas por los fabricantes, a 4¼C durante la noche. Tras varios lavados, los anticuerpos unidos se detectaron con IgGs unidas a peroxidasa, especificas para la detecci—n de la especie en la que se obtuvo el primario. Las bandas se visualizaron por ECL (VWR International, Canada). El an‡lisis cuantitativo de las bandas se realiz— por densitometr’a en un densit—metro GS-800 de BioRad utilizando el software Quantity One 4.6.

2. 2. Obtenci—n de sinaptosomas purificados de mŽdula espinal de rata

Se sacrificaron 6-8 ratas adultas por intoxicaci—n con mon—xido de carbono. Se decapitaron y se extrajeron las mŽdulas espinales. Tras un homogeneizado en potter tipo Dounce vidrio-vidrio, se realizaron las siguientes centrifugaciones a 4¼C en rotores JA.25.50 de Beckman: a) 4 min, 5500 r.p.m. y se recuper— el sobrenadante, b) 15 min, 14000 r.p.m. se retir— el sobrenadante y se resuspendi— el sedimento en buffer sacarosa 0,32 M pH 7,4. c) 7 min, 17000 r.p.m., tras colocar la muestra en un gradiente discontinuo (25% - 15% - 5%) de Percoll (Sigma) disuelto en buffer sacarosa 0,32 M pH 7,4. Se recuper— la interfase entre 15-25% y se resuspendi— en HBM (ClNa 140 mM, ClK 5 mM, Cl2Ca 1mM, Cl2Mg 1mM, Na2HPO4 1mM, HNaCO3, HepesNaOH pH 7,4 20mM, Glucosa 10mM) para realizar dos nuevas centrifugaciones que lavan el sedimento de Percoll d) 15 min, 15000 r.p.m. y e) 10 min 5500 r.p.m. Se resuspendi— en HBM, se midi— prote’na por Bradford y se ajust— a 2 mg/ml.

2. 3. Transporte de glicina tritiada en sinaptosomas

Tras el correspondiente tratamiento de los sinaptosomas con PGE2 u otro compuesto, se midi— la glicina tritiada incorporada en estos. As’, se a–aden 40 µg de sinaptosomas por condici—n (utilizando como m’nimo cuadruplicados) a medio HBM atemperado a 37¼C que contiene NFPS 10 µM (para inhibir GlyT1) y 2µl/ml de [3H]-glicina, 1.6 TBq/mmol (PerkinElmer Life Sciences), diluida isot—picamente una concentraci—n de 10µM. Tras 10 minutos de incubaci—n en agitaci—n a 37¼C, se lavaron con phosphate-buffered saline (PBS) (NaCl 137 mM, 0.9mM CaCl2, 2.68mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 0.49mM MgCl2, 7.37 mM Na2HPO4, pH 7.4) para retirar la [3H]-glicina no incorporada al interior de los sinaptosomas. El transporte de GlyT2 se mide como la diferencia entre la acumulaci—n de [3H]-glicina a 10 µM, restando la acumulaci—n obtenida en presencia del inhibidor espec’fico de GlyT2 (ALX-1393) que corresponder’a al transporte basal de los sinaptosomas.

2. 4. Inmunoprecipitaci—n anti-multi ubiquitina

Se separaron 200 ug de sinaptosomas por condici—n, que fueron lisados en buffer de lisis conteniendo NP-40 0,25%, NaCl 150mM, Tris-HCl 25mM y N-Etilmaleimida 50mM. Tras 30 minutos a temperatura ambiente en agitaci—n, se centrifugaron las diferentes muestras para retirar restos celulares no solubilizados y se incubaron una hora a temperatura ambiente en presencia de un anticuerpo anti-multi ubiquitina unido a agarosa (clon FK2). Las prote’nas ubiquitinadas se aislaron por precipitaci—n de la agarosa mediante una centrifugaci—n suave (8000 r.p.m., 3 min), se eluyeron a 75¼C durante 10 minutos y se cargaron en un gel SDS-PAGE, revelando por western blot la cantidad de GlyT2 ubiquitinado.

2. 5. An‡lisis estad’stico

Los datos se muestran como medias ± error est‡ndar de la media (Standard Error Mean, SEM). Las diferencias estad’sticas entre dos grupos se determinaron por una prueba t de Student, mientras que la comparaci—n entre m‡s de dos grupos se realiz— mediante el an‡lisis de la varianza (ANOVA, ANalysis Of VAriance, segœn terminolog’a inglesa). P < 0,05 se consider— significativo, y es denotado con *. Otras equivalencias son ** para P < 0,01 y *** para P < 0,001.

3. RESULTADOS

3.1. PGE2 activa la recaptaci—n de glicina mediada por el transportador GlyT2 a travŽs de la activaci—n de los receptores EP3

Teniendo en cuenta el papel cr’tico que juega GlyT2 en la neurotransmisi—n glicinŽrgica (21) y la regulaci—n que PGE2 produce sobre la misma (14), nos preguntamos si la actividad de GlyT2 se ver’a afectada junto a la del receptor de glicina, modulando de manera coordinada el proceso desde las neuronas pre- y postsin‡pticas. Para ello medimos la actividad espec’fica de GlyT2 en sinaptosomas de mŽdula espinal de rata en presencia o ausencia de 10 µM PGE2 durante diferentes tiempos. Estas medidas se realizan midiendo la cantidad de glicina tritiada incorporada en los sinaptosomas por unidad de tiempo, y se realizan en presencia de NFPS (un inhibidor espec’fico de GlyT1) para cuantificar el transporte de glicina radiactiva œnicamente debido a la actividad de GlyT2. Como se observa en la Figura 1, fuimos capaces de determinar que efectivamente PGE2 produce variaciones sobre la recaptaci—n llevada a cabo por GlyT2. As’, observamos que la actividad de GlyT2 aumenta de un modo dependiente del tiempo en presencia de PGE2, llegando a alcanzar un aumento del transporte del 66,43 ± 6,3% a los 60 minutos, pero detect‡ndose a los 30 min con una activaci—n significativa del 32,33 ± 4,1%.

Figura 1.- PGE2 activa el transporte mediado por GlyT2 en sinaptosomas de mŽdula espinal de rata. Los sinaptosomas de mŽdula espinal de rata fueron incubados durante los tiempos indicados en presencia de 10 µM PGE2. Se determin— la cantidad de glicina tritiada incorporada, midiendo cada tiempo ensayado por cuadruplicado, y se muestra la media resultante de cuatro experimentos ± SEM (error est‡ndar de la media). La comparaci—n entre los distintos tiempos se realiz— mediante el an‡lisis de la varianza (ANOVA). Los niveles de significaci—n corresponden a * p < 0,05 y *** p < 0,001.

La PGE2 es liberada durante eventos de dolor inflamatorio, y puede realizar su efecto a travŽs de cuatro posibles receptores: EP1, EP2, EP3 y EP4. Estos receptores se expresan en una amplia de mayor’a tejidos, incluyendo la mŽdula espinal (22, 23) y median su acci—n a travŽs de diferentes cascadas de se–alizaci—n (24, 25). Para determinar la implicaci—n de los distintos subtipos de receptores en la activaci—n de GlyT2 por PGE2, quisimos cuantificar la expresi—n de cada uno en sinaptosomas de mŽdula espinal de rata. De este modo, la expresi—n del receptor, que est‡ estrechamente ligada a su posible acci—n, indica la capacidad de transducci—n de esa v’a en concreto en la muestra de interŽs. As’, mediante la tŽcnica de Western blot y detecci—n con anticuerpos espec’ficos de cada subtipo de receptor pudimos observar y cuantificar la expresi—n de cada uno, detectando una mayor expresi—n de los receptores EP1 y EP3, y una menor expresi—n de los receptores EP2 y EP4 (Figura 2A-B), lo que sugerir’a una mayor implicaci—n de EP1 y EP3 en la activaci—n de GlyT2. Aunque algunos efectos inducidos por PGE2 en distintos tejidos son mediados por la contribuci—n de varios subtipos de receptores EP a la vez (26, 27), lo m‡s comœn es que œnicamente la transducci—n a travŽs de un solo subtipo resulte determinante para el efecto concreto (19, 28-31). De este modo, para determinar la implicaci—n de cada posible v’a de transducci—n utilizamos agonistas espec’ficos de cada uno de los receptores, intentando determinar la contribuci—n aislada de cada subtipo de receptor sobre la activaci—n de GlyT2 mediada por PGE2. Los agonistas utilizados fueron: sulprostona, beraprost, butaprost y TCS250. La sulprostona activa los receptores EP1 y EP3 con unas constantes de afinidad de 21 nM y 0,6 nM (25), de manera que puede ser utilizada para determinar el efecto de ambos receptores a la vez. beraprost es un agonista para EP2, Butaprost activa selectivamente a EP3 y TCS250 es un compuesto relativamente reciente que activa espec’ficamente a EP4.

Figura 2.- Los receptores EP3 y EP1 se expresan en mayor medida que los receptores EP2 y EP4 en sinaptosomas de mŽdula espinal de rata. A-B) 20 µg/carril de lisados de sinaptosomas de mŽdula espinal de rata fueron cargados en gel SDS-PAGE. Cada receptor se revel— con su anticuerpo espec’fico, y se reincub— anti-calnexina (CNX) como control de carga. B) La densitometr’a de cada receptor fue normalizada respecto a la detecci—n de CNX, y se representa con unidades arbitrarias.

El efecto de cada uno de estos compuestos fue ensayado sobre la actividad end—gena de GlyT2 en sinaptosomas de mŽdula espinal de rata (Figura 3). As’, se observ— que el tratamiento durante una hora a 37¼C con estos compuestos produc’a distintos efectos; mientras que la activaci—n selectiva de EP2 o EP4 no es capaz de emular el efecto de PGE2, la activaci—n de EP1 y EP3, o solamente EP3, produc’a un fenotipo similar al observado en presencia de la prostaglandina. De estos resultados se desprende que la contribuci—n de la activaci—n de EP2 y EP4 al efecto ejercido por PGE2 sobre GlyT2 es m’nima y, por otro lado, mientras que el efecto de la sulprostona podr’a sugerir la implicaci—n simult‡nea de los receptores EP1 y EP3, los resultados con butaprost confirman que œnicamente la activaci—n de EP3 es capaz de aumentar la actividad de GlyT2, con lo que se podr’a deducir que la contribuci—n de EP1 es probablemente muy baja. As’, el conjunto de estos resultados implica directamente al subtipo EP3 en la regulaci—n de GlyT2 por PGE2 en la presinapsis.

Figura 3.- La activaci—n espec’fica de los receptores EP1 y EP3, o s—lo EP3 produce una activaci—n en el transporte de GlyT2. A-B) Los sinaptosomas de mŽdula espinal de rata fueron incubados durante 1 hora a 37¼C en presencia de veh’culo (Veh), PGE2, sulprostona, beraprost, butaprost y TCS250 (todos ellos a 10 µM). Se determin— la cantidad de glicina tritiada incorporada, midiendo cada tiempo ensayado por cuadruplicado, y se muestra el diagrama de barras correspondiente a la media de tres experimentos independientes ± SEM (error est‡ndar de la media). B) Tabla de correspondencias entre los diferentes agonistas y los receptores que activan espec’ficamente, mostrando en la columna de la derecha el % de activaci—n en cada condici—n.

3. 2. La presencia de PGE2 reduce la ubiquitinaci—n de GlyT2

En el caso de GlyT2 y otros transportadores de neurotransmisores, la ubiquitinaci—n se ha demostrado como una herramienta eficiente que posee la cŽlula para mantener un control fino del nœmero de molŽculas presentes en la membrana plasm‡tica, de tal modo que la imposibilidad de adici—n de molŽculas de ubiquitina a los transportadores se traduce en un aumento del nœmero de molŽculas activas en la superficie celular, ya que su endocitosis se encuentra bloqueada (7, 8, 32, 33). Por tanto, quisimos determinar si el aumento de actividad de GlyT2 por PGE2 podr’a estar relacionado con variaciones en el estado de ubiquitinaci—n del transportador. Para ello realizamos incubaciones de sinaptosomas durante una hora en presencia o ausencia de 10µM PGE2, y cuantificamos la cantidad de GlyT2 ubiquitinado. Esto se realiza mediante el uso de un anticuerpo anti-multi ubiquitina unido a agarosa (clon FK2), que reconoce prote’nas mono y poliubiquitinadas, pero no ubiquitina libre (34). De este modo, desde un lisado de sinaptosomas previamente tratados con PGE2 o veh’culo se pueden inmunoprecipitar y aislar todas las prote’nas ubiquitinadas y, mediante Western blot, podemos cuantificar œnicamente las variaciones que se han producido sobre GlyT2 y establecer diferencias.

Como se observa en la Figura 4, mientras que la cantidad de prote’na total correspondiente a GlyT2 no se ve afectada por la presencia de PGE2, la proporci—n de transportador ubiquitinado disminuye significativamente hasta un 68,74 ± 5,6%. Estos resultados sugerir’an que la activaci—n del transporte espec’fico de GlyT2 en presencia de PGE2, presumiblemente a travŽs de los receptores EP3, puede deberse a la disminuci—n de la ubiquitinaci—n del transportador. Esto favorecer’a la proporci—n de GlyT2 desubiquitinado incapaz de endocitar al interior celular, aumentando por tanto el nœmero de molŽculas activas en la superficie celular. As’, se producir’a un aumento global de la recaptaci—n de glicina en la sinapsis y por tanto una menor neurotransmisi—n por falta de neurotransmisor en el espacio sin‡ptico, lo que contribuye y refuerza, desde la presinapsis, a la inhibici—n de la neurotransmisi—n glicinŽrgica debida a la disminuci—n de la actividad del receptor postsin‡ptico (18).

Figura 4.- PGE2 disminuye la ubiquitinaci—n de GlyT2. A-B) 200 µg de sinaptosomas de mŽdula espinal de rata fueron incubados durante 1 hora a 37¼C en presencia de veh’culo (Veh) o 10 µM PGE2. DespuŽs de esto se separaron 10 µg para cuantificar prote’na total (A, parte izquierda) y sobre el resto (190 µg) se inmunoprecipitaron las prote’nas ubiquitinadas con un anticuerpo anti-multi ubiquitina unido a agarosa. Tras separar las prote’nas en gel SDS-PAGE se determin— la cantidad de GlyT2 total y ubiquitinado (A, parte derecha). Como se observa, la presencia de PGE2 produce una bajada de GlyT2 ubiquitinado, mientras que la prote’na total se mantiene constante. B) Cuantificaci—n de tres experimentos independientes como el mostrado en A. Se muestra la cantidad de GlyT2 ubiquitinado como porcentaje del control (Veh). La comparaci—n entre ambas condiciones se realiz— mediante una prueba t de Student. p < 0,05 se consider— significativo, y se denota con *.

4. discusi—n

La falta de inhibici—n mediada por la neurotrasmisi—n glicinŽrgica en la mŽdula espinal se ha demostrado como una caracter’stica claramente implicada en el aumento de la sensaci—n de dolor (14, 35). Uno de los mecanismos descritos que regula este tipo de neurotransmisi—n se basa en una inhibici—n espec’fica de la subunidad GlyRα3 del receptor de glicina en presencia de la prostaglandina E2 (PGE2), uno de los mediadores m‡s importantes de la inflamaci—n (15-17). Esta inhibici—n ocurre a travŽs de los receptores EP2, que producen un aumento del AMPc intracelular. Esto provoca una activaci—n a la prote’na kinasa A (PKA) que fosoforila espec’ficamente a la subunidad GlyRα3 del receptor de glicina en la serina de la posici—n 346, impidiendo su acci—n y por tanto reduciendo la neurotransmisi—n glicinŽrgica inhibidora (18).

El —ptimo funcionamiento de la neurotransmisi—n glicinŽrgica requiere por tanto la correcta actividad y localizaci—n del receptor de glicina. Sin embargo, otras muchas prote’nas son necesarias, y tienen la capacidad de regular este tipo de neurotransmisi—n. Un ejemplo claro es el transportador neuronal presin‡ptico GlyT2, ya que ratones deficientes en esta prote’na tienen completamente alterada la neurotransmisi—n glicinŽrgica (21). Sin embargo, hasta la fecha se han realizado muy pocos estudios que profundicen sobre la posible implicaci—n de este transportador en el procesamiento del dolor, a pesar de que recientemente se ha propuesto como una interesante diana analgŽsica, ya que se ha descrito que su bloqueo farmacol—gico espec’fico parece reducir la sensaci—n de dolor en ratas (36, 37).

De este modo, consideramos de interŽs profundizar en los mecanismos moleculares de la posible implicaci—n de GlyT2 en la acci—n de PGE2 sobre la inhibici—n glicinŽrgica. En este trabajo hemos observado que PGE2 produce una activaci—n de la recaptaci—n presin‡ptica llevada a cabo por GlyT2 y, gracias al uso de agonistas espec’ficos de los receptores EP de la prostaglandina, hemos podido determinar la implicaci—n del subtipo de receptor EP3 en el efecto observado. En consonancia con esto, hemos detectado que la expresi—n del receptor EP3 en sinaptosomas de mŽdula espinal de rata est‡ muy por encima de la expresi—n de los subtipos EP2 y EP4, y ligeramente por encima de la expresi—n de EP1, lo que es coherente con los resultados obtenidos.

En concreto, la activaci—n de los receptores EP3 conlleva usualmente disminuciones notables de AMP c’clico (AMPc) y aumentos en la concentraci—n de calcio (Ca+2) intracelular (24). Se ha descrito que aumentos de Ca+2 intracelular pueden producir una desubiquitinaci—n de un amplio nœmero de prote’nas en la sinapsis (38) por lo que quisimos comprobar si GlyT2 podr’a sufrir desubiquitinaci—n tras un aumento de Ca+2 intracelular llevado a cabo por la activaci—n del receptor EP3. Esto se realiz— inmunoprecipitando prote’nas ubiquitinadas desde sinaptosomas de mŽdula de rata, y comprobando si PGE2 produc’a cambios en la cantidad de GlyT2 ubiquitinado. Los resultados mostraron una disminuci—n significativa en la ubiquitinaci—n de GlyT2 tras el tratamiento con PGE2, mientras que la cantidad total de prote’na no se vi— afectada. La ubiquitinaci—n de GlyT2 ha sido recientemente descrita como una modificaci—n necesaria para la endocitosis del transportador, de tal modo que la incapacidad de ubiquitinar a GlyT2 en la lisina 791 de su carboxilo terminal impide su endocitosis regulada por PKC (8). La imposibilidad de endocitosis por la falta de ubiquitinaci—n produce, por tanto, un acœmulo del transportador en la superficie celular (como ocurre con otras prote’nas; 39), lo que conlleva un aumento del nœmero de molŽculas activas en membrana plasm‡tica, aumentando por tanto la actividad global de GlyT2. Este aumento de actividad produce una aceleraci—n de la recaptaci—n del neurotransmisor, disminuyendo el tiempo de acci—n de este en el espacio sin‡ptico y reduciendo la acci—n sin‡ptica de la glicina.

En conjunto, estos datos muestran que PGE2 disminuye la neurotransmisi—n glicinŽrgica mediante dos efectos coordinados en la postsinapsis y en la presinapsis: 1) en la postsinapsis promueve una disminuci—n de la actividad del receptor GlyRα3 por fosforilaci—n directa dependiente de la transducci—n por receptores EP2 (18); y 2) en la presinapsis produce un aumento de la recaptaci—n de glicina desde el espacio sin‡ptico mediada por el transportador GlyT2, presumiblemente a travŽs de los receptores EP3 y que probablemente es debida a un acœmulo de transportador activo desubiquitinado en la superficie neuronal (Figura 5). As’, el transporte mediado por GlyT2 estar’a sobreactivado en situaciones de dolor inflamatorio dependientes de PGE2. GlyT2 podr’a representar una posible diana terapŽutica en estas situaciones, ya que su inhibici—n espec’fica aumentar’a la presencia de glicina en el espacio sin‡ptico y por tanto activar’a la neurotransmisi—n glicinŽrgica reduciendo la transmisi—n de la se–al nociceptiva.

Figura 5.- Esquema-resumen de la acci—n inhibidora coordinada de PGE2 sobre neuronas presin‡pticas y postsin‡pticas en la neurotransmisi—n glicinŽrgica. Se muestra en la zona de la derecha un resumen de la acci—n previamente descrita (18) sobre el receptor GlyRα3: PGE2 interacciona con el receptor EP2, y este activa a la prote’na kinasa A (PKA) mediante la transducci—n llevada a cabo por prote’nas G estimuladoras (Gs). La PKA fosforila a GlyRα3, bloqueando su acci—n e impidiendo la entrada de iones cloruro (Cl-) en la neurona postsin‡ptica (18). En la zona de la izquierda se muestra la regulaci—n de PGE2 descrita en este art’culo sobre la presinapsis: PGE2 interacciona con el receptor EP3, y este produce una bajada de AMPc y un aumento de la concentraci—n de calcio intracelular (Ca+2) mediante la transducci—n llevada a cabo por prote’nas G inhibidoras (Gi). Mediante mecanismos aœn por determinar (denotados por ÒÀ?Ó) la bajada de AMPc o el aumento Ca+2 producen un desequilibrio del ciclo ubiquitinaci—n/desubiquitinaci—n del transportador de glicina presin‡ptico GlyT2 por dos posibilidades: 1) inactivaci—n de la E3 ligasa correspondiente (en rojo) o 2) activaci—n de la desubiquitinasa correspondiente (DUB; en verde). De este modo, se reduce la ubiquitinaci—n de GlyT2, lo que produce una acumulaci—n del transportador en membrana, y por tanto un aumento de la recaptaci—n de glicina (Gly) liberada. Esto disminuye la concentraci—n efectiva de glicina en el espacio sin‡ptico y limita su acci—n como neurotransmisor.

5. agradecimientos

Este trabajo se ha realizado con la financiaci—n del Ministerio de Ciencia e Innovaci—n (SAF2008-05436 y SAF2011-28674), la Comunidad Aut—noma de Madrid (SSAL-0253/2006) y la Fundaci—n Ram—n Areces.

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