SESIONES
CIENTêFICAS |
Sesi—n cient’fica conmemorativa del Premio Nobel 2012 de Fisiolog’a o Medicina y del Premio Nobel de Qu’mica
Juan
Ram—n Lacadena Calero
Coordinador de la sesi—n.
Sesi—n celebrada el 13 de diciembre de 2012
e-mail: edicion@ranf.com
ORDEN DEL DêA
Presentaci—n:
Excmo. Sr. D. Juan-Ram—n Lacadena Calero
AcadŽmico de Nœmero de la Real Academia Nacional de Farmacia
Ponentes:
ÒUna familia de receptores de membrana esencial para la comunicaci—n celularÓ
Prof. Dr. Federico Mayor MenŽndez
Catedr‡tico de Inmunolog’a, Facultad de Medicina, UAM. Director Cient’fico, Instituto de Investigaci—n Sanitaria Princesa. Hospital Universitario de la Princesa
ÒRebobinando la pel’cula genŽtica del desarrollo"
Excmo. Sr. D. Juan-Ram—n Lacadena Calero
Premios Nobel de Qu’mica 2012: Una familia de receptores de membrana esencial para la comunicaci—n celular
Federico Mayor MenŽndez
Departamento de Biolog’a Molecular y Centro de Biolog’a Molecular ÒSevero OchoaÓ (CSIC-Universidad Aut—noma de Madrid), Universidad Aut—noma, 28049 Madrid (Espa–a).
e-mail: fmayor@cbm.uam.es
Recibido el 18 de febrero de 2013 An. Real Acad. Farm. Vol 79, N¼ 1 (2013), pag. 132-150.
RESUMEN
El premio Nobel de Qu’mica 2012 ha sido otorgado a los investigadores estadounidenses Robert J. Lefkowitz y Brian K Kobilka por sus estudios sobre los receptores acoplados a prote’nas G. Esta familia de prote’nas de membrana son los sensores biol—gicos m‡s extendidos y vers‡tiles, responsables en buena medida de la capacidad de nuestras cŽlulas de recibir mensajes del entorno. Son tambiŽn la diana de numerosos f‡rmacos utilizados para el tratamiento de mœltiples patolog’as. El trabajo de Lefkowitz ha sido decisivo para desvelar la naturaleza qu’mica de estos receptores y para entender mejor sus mecanismos de se–alizaci—n y de regulaci—n. Lefkowitz y Kobilka consiguieron tambiŽn identificar el gen que codificaba para el receptor beta-adrenŽrgico, lo que permiti— posteriormente desvelar la existencia de mœltiples receptores de caracter’sticas similares. Finalmente, Kobilka ha utilizado la difracci—n por rayos X para determinar la estructura ’ntima de estas prote’nas. El camino abierto por Lefkowitz y Kobilka permitir‡ conocer mejor las alteraciones de receptores en situaciones patol—gicas y avanzar en el dise–o de nuevas estrategias terapŽuticas. |
Palabras clave: Receptores; Prote’nas G; Se–alizaci—n celular.
ABSTRACT
A essential family for cellular communication membrane receptors
The Nobel Prize in Chemistry 2012 has been awarded to Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka for their studies on G-protein-coupled receptors. The components of this family of membrane proteins are ubiquitous and versatile biological sensors that play an essential physiological role by allowing our cells to respond to external stimuli. GPCR also are very important pharmacological targets for the treatment of a variety of pathological conditions. The contributions of Lefkowitz have been decisive in unveiling the chemical nature of these receptors and to better understand their signaling and regulatory mechanisms. Lefkowitz and Kobilka also cloned the beta-adrenergic receptor gene and paved the way for the identification of a large family of structurally-related receptor proteins. Finally, Kobilka has recently determined the tridimensional structure of prototypical GPCRs. The work by Lefkowitz and Kobilka opens exciting avenues for a better knowledge of receptor alterations in pathological situations and for the design of novel therapeutic strategies. |
Keywords: Receptors, G proteins, Cell signaling.
1. Introducci—n
El premio Nobel de Qu’mica 2012 ha reconocido los decisivos estudios de Robert Lefkowitz y Brian Kobilka en la identificaci—n y caracterizaci—n de los denominados "receptores acoplados a prote’nas G" (conocidos en el ‡mbito cient’fico como GPCR, por las siglas correspondientes a ÒG protein-coupled receptorsÓ en idioma inglŽs), de ampl’sima relevancia fisiol—gica y farmacol—gica (1). En este caso concreto, debo decir que a la satisfacci—n de todo cient’fico cuando se reconocen los mŽritos de unos colegas, se suma un componente m‡s personal, ya que conozco muy directamente a los dos premiados, desde que fui disc’pulo del Profesor Lefkowitz durante mi estancia en Duke University (Carolina del Norte) en los a–os 1985-1986, periodo en el que Brian Kobilka tambiŽn formaba parte de su laboratorio. La superfamilia de receptores acoplados a prote’nas G constituye un elemento central en las redes de se–alizaci—n celular, por las que se transfiere informaci—n biol—gica del entorno, y cuyo conocimiento es esencial para entender el funcionamiento de los seres vivos y en particular de los organismos multicelulares.
2. Comunicaci—n celular: capacidad de respuesta a cambios en el entorno
Todas las cŽlulas deben recibir continuamente informaci—n del ambiente que las rodea, y tomar decisiones basadas en esa informaci—n. As’, los organismos unicelulares necesitan distinguir los nutrientes que se encuentran en su cercan’a, y regular sus procesos metab—licos de acuerdo con esas disponibilidades.
En el caso de las cŽlulas de los organismos multicelulares, es preciso que integren la informaci—n procedente de las cŽlulas vecinas y del conjunto del organismo, para tomar decisiones tales como reproducirse, especializarse, moverse a otro sitio o morir. Por tanto, comprender c—mo las cŽlulas reciben y coordinan se–ales del entorno y de otras cŽlulas del mismo organismo es esencial para entender procesos biol—gicos b‡sicos (como la proliferaci—n, diferenciaci—n y apoptosis), la organizaci—n en tejidos, el metabolismo, la migraci—n de las cŽlulas o la propia percepci—n sensorial.
Antes de la aparici—n de los organismos multicelulares, los organismos unicelulares ya hab’an desarrollado mecanismos para responder a cambios en el medio y a detectar en Žl la presencia de otras cŽlulas. El advenimiento de organismos multicelulares durante el proceso evolutivo precis— del desarrollo de nuevos sistemas de control de la actividad celular, del establecimiento de normas estrictas que regulasen el funcionamiento de cada una de las cŽlulas especializadas del organismo para el beneficio del conjunto.
Adem‡s, deb’a asegurarse que la puesta en marcha de respuestas celulares se coordinase de tal manera que todas las cŽlulas implicadas en un proceso biol—gico reaccionasen al un’sono durante el desarrollo embrionario o ante respuestas fisiol—gicas. La soluci—n evolutiva a estas necesidades de Òsocializaci—nÓ celular fue el desarrollo de un ÒlenguajeÓ muy elaborado de comunicaci—n, capaz no s—lo de captar las se–ales externas (particularmente a travŽs de los sistemas de percepci—n sensorial como la vista o el olfato), sino de integrar la informaci—n procedente de las cŽlulas vecinas y del conjunto del organismo, mediante el establecimiento de rutas complejas de se–alizaci—n que coordinasen y ejecutasen las respuestas celulares ante cambios ambientales, metab—licos o patogŽnicos del organismo.
A nivel molecular, los sistemas de se–alizaci—n celular y de control de la expresi—n gŽnica controlan el flujo de informaci—n desde el DNA a RNA, y de Žste a prote’nas (en los procesos de transcripci—n y traducci—n, respectivamente) y , en niveles de integraci—n superior, regulan din‡micamente el interactoma (las mœltiples redes de interacciones que establecen las prote’nas y que sustentan las funciones celulares) y la funci—n fisiol—gica integrada en el organismo global, resultado de la coordinaci—n de todas esas funciones celulares , lo que se ha llamado ÒfisiolomaÓ. La extraordinaria tarea de estos procesos de coordinaci—n de la actividad celular resulta evidente si se considera que un ser humano adulto consta de aproximadamente 80-100 millones de millones de cŽlulas, de unos 300 tipos celulares distintos, agrupadas en distintos tejidos y —rganos, formando entre s’ una intricada red de conexiones funcionales.
Mensajeros, receptores y cascadas de se–alizaci—n intracelular: los GPCR como la familia de receptores m‡s extendida y vers‡til
Los sistemas de se–alizaci—n son extraordinariamente complejos, asemej‡ndose a complicadas redes o circuitos con mœltiples elementos de intersecci—n y control. En general, estos sistemas se basan en la existencia de molŽculas (denominadas mensajeros, hormonas, neurotransmisores, o mediadores qu’micos locales segœn su origen celular, forma de liberaci—n, y funci—n) que llevan Ò—rdenesÓ s—lo a aquellas cŽlulas que poseen receptores espec’ficos para reconocer a esa molŽcula.
Los receptores tienen la capacidad de actuar como detectores de se–ales y de transformar ese acto de reconocimiento molecular en una se–al intracelular (denominada Òsegundo mensajeroÓ). Los segundos mensajeros, ya desde dentro de la cŽlula, modifican la actividad, localizaci—n o interacciones entre prote’nas celulares (controlando as’ el metabolismo, o la funci—n del citoesqueleto, por ejemplo) y tambiŽn regulan la expresi—n gŽnica, promoviendo una respuesta celular espec’fica e integrada (Figura 1). Por tanto, los sistemas de se–alizaci—n celular est‡n normalmente organizados en etapas secuenciales de detecci—n, transformaci—n, amplificaci—n y diseminaci—n de la se–al, que son un poderoso instrumento para el control de las principales funciones celulares.
Figura 1.- Organizaci—n de las cascadas de se–alizaci—n controladas por receptores situados en la membrana plasm‡tica.
Es importante recordar que estos sistemas, para ser eficaces, tienen que funcionar de forma transitoria y controlada de tal forma que s—lo persista la se–al mientras lo haga el mensajero. Por tanto, tienen que existir adem‡s procesos de terminaci—n, adaptaci—n e integraci—n que aseguren en todo momento su activaci—n y desactivaci—n controlada.
La mayor’a de los mensajeros se unen a receptores situados en la membrana plasm‡tica de las cŽlulas diana. Se distinguen tres grandes clases de receptores, definidos por su ÒestrategiaÓ para transformar la se–al extracelular en una intracelular (Figura 1):
á Receptores acoplados a canales i—nicos. Son prote’nas de membrana que dejan pasar iones a travŽs de ellas s—lo si est‡ presente el mensajero en la parte extracelular. Estos receptores actœan como ÒcompuertasÓ que se abren transitoriamente dejando pasar calcio, sodio o cloruro (dependiendo del receptor) a favor de su gradiente electroqu’mico. Este tipo de receptores (constituidos por varias subunidades de prote’nas transmembrana) son especialmente abundantes en cŽlulas excitables caracterizadas por una gran rapidez de respuesta, como las neuronas o las cŽlulas musculares.
á Receptores con actividad enzim‡tica propia. Son en general prote’nas con una regi—n transmembrana que presentan un sitio de uni—n del mensajero situado en el exterior de la cŽlula y una zona con actividad enzim‡tica (sitio catal’tico) en el interior. La uni—n del mensajero provoca cambios en el receptor (que en muchos casos implica su dimerizaci—n, es decir, su cercan’a a otro receptor similar) que resultan en la estimulaci—n de su actividad catal’tica. Muy frecuentemente esa actividad es de tipo quinasa, es decir, provoca la fosforilaci—n en un residuo de tirosina, de serina o de treonina de la propia prote’na receptora y de otras prote’nas celulares, modificando transitoriamente su funci—n. Muchos mensajeros de tipo pept’dico, como la insulina, y muchos factores que controlan el crecimiento de las cŽlulas utilizan este tipo de receptores.
á Receptores acoplados a prote’nas G. En las dos tipos de receptores anteriores, la capacidad de reconocer al mensajero y de promover y amplificar una se–al intracelular (a travŽs de un canal i—nico o una actividad enzim‡tica) resid’an en la misma prote’na. En este œltimo tipo participan 3 prote’nas de membrana distintas: el receptor (que es en este caso una prote’na que atraviesa 7 veces la membrana), unas prote’nas transductoras denominadas prote’nas G (situadas en la periferia interna de la membrana plasm‡tica) y otra prote’na efectora o amplificadora. Entre estas prote’nas efectoras se encuentran la adenilil ciclasa (que produce el segundo mensajero denominado AMP c’clico a partir del ATP celular), fosfolipasas (que ÒliberanÓ segundos mensajeros ÒalmacenadosÓ en forma de l’pidos en la membrana), o canales para diversos iones. Este sistema de se–alizaci—n ha tenido un gran ÒŽxito evolutivoÓ, ya que es la familia de receptores m‡s extensa, m‡s ubicua y m‡s vers‡til. Los humanos tenemos casi mil receptores de esta familia en nuestro genoma (1-4), capaces de reconocer espec’ficamente a un repertorio extremadamente variado de est’mulos, desde fotones en la retina a mœltiples aromas en el epitelio olfativo, pasando por receptores para aminas bi—genas, amino‡cidos, derivados lip’dicos, pŽptidos y prote’nas en mœltiples tejidos, que controlan mœltiples aspectos de la funci—n celular y de la homeostasis del organismo (Figura 2).
Figura 2.- Se–alizaci—n mediada por receptores acoplados a prote’nas G. La llegada del agonista promueve la interacci—n del receptor con la prote’na G y el intercambio de GDP por GTP, lo que a su vez conduce a la disociaci—n de las subunidades de la prote’na G heterotrimŽrica, que pueden entonces interaccionar con efectores espec’ficos y controlar una gran variedad de procesos celulares b‡sicos, la percepci—n sensorial y diversos aspectos de la homeostasis del organismo. La activaci—n de las prote’nas G es transitoria, ya que su capacidad GTPasa (estimuladas por las prote’nas GAP o RGS) vuelve el sistema a su situaci—n basal.
Las prote’nas G son interruptores moleculares que se activan transitoriamente. Estas prote’nas pueden encontrarse en dos conformaciones espaciales diferentes: una forma inactiva, cuando unen al nucle—tido GDP, y otra forma activada capaz de unirse con otras prote’nas celulares denominadas efectoras, cuando unen GTP. Pero esta activaci—n es intr’nsecamente transitoria, ya que estas prote’nas son GTPasas, es decir, destruyen al cabo de un breve tiempo el GTP transform‡ndolo de nuevo en GDP, y vuelven as’ a su estado basal. Tanto el encendido (intercambio de GDP por GTP) como el apagado (hidr—lisis de GTP) de este interruptor molecular se pude modular por su interacci—n con otras prote’nas.
Hoy sabemos que cuando los GPCR reconocen a su mensajero (por ejemplo, el receptor de adrenalina a la adrenalina), cambian su conformaci—n y pueden entonces interaccionar con una prote’na G de tipo heterotrimŽrico unida a GDP, lo que a su vez promueve el intercambio de GTP por GDP. La prote’na G en su estado activo interacciona con efectores (como la adenilil ciclasa) modificando par‡metros intracelulares que diseminan la se–al extracelular. Las subunidades Gbetagamma que se liberan simult‡neamente pueden tambiŽn actuar sobre diversos efectores celulares (Figura 2) Posteriormente, la prote’na G hidroliza GTP a GDP (en un proceso que puede ser activado por familias de prote’nas estimuladoras de la actividad GTPasa, denominadas GAP o RGS (5,6) y el sistema vuelve a su conformaci—n basal. S—lo si sigue habiendo mensajero en el exterior de la cŽlula se repetir‡ el ciclo de activaci—n y desactivaci—n.
Los GPCR son tambiŽn muy relevantes por sus implicaciones fisiopatol—gicas y en farmacolog’a (1,4,7,8). En muchas enfermedades se encuentran alterados los niveles de mensajeros y/o las rutas de se–alizaci—n que controlan GPCRs. Por ejemplo, en patolog’as cardiovasculares existen aumentos en los niveles de mensajeros como catecolaminas, angiotensina o endotelina, que alteran a su vez el normal funcionamiento y crecimiento de tipos celulares cardiovasculares, y pueden conducir a hipertrofia cardiaca y a fallo cardiaco. La gran capacidad de control de las funciones celulares de los GPCR puede aprovecharse para modificarla de la forma m‡s eficaz y espec’fica posible.
As’, pueden seleccionarse o dise–arse compuestos qu’micos capaces de unirse con gran afinidad a los mismos receptores que nuestros mensajeros internos, consiguiendo as’ mimetizar (agonistas) o impedir (antagonistas) su acci—n. Por ejemplo, agonistas de receptores beta2-adrenŽrgicos son eficaces broncodilatadores y se utilizan para tratar el asma; antagonistas beta1-adrenŽrgicos se utilizan para el tratamiento de la hipertensi—n; antagonistas del receptor H2 de la histamina inhiben la excesiva secreci—n g‡strica; agonistas de receptores de opi‡ceos, como la morfina, se utilizan como analgŽsicos, etc.
3. Evoluci—n del concepto de receptor
El concepto de receptores como elementos sensores del entorno se remonta a Paul Ehrlich en el a–o 1903, cuando se avanz— la idea de que las sustancias biol—gicamente activas podr’an unirse a sitios espec’ficos en las superficies de las cŽlulas. Posteriormente, en la primera dŽcada del siglo XX, JN Langley y su estudiante Henry Dale fueron los primeros en proponer expl’citamente la idea de una sustancia receptora en las cŽlulas capaces de responder a est’mulos, basados en experimentos cl‡sicos de fisiolog’a y farmacolog’a, utilizando preparaciones de mœsculo esquelŽtico o liso y de gl‡ndulas salivales para estudiar los efectos de la adrenalina o la acetil-colina (9, 10). Sin embargo, la naturaleza f’sico-qu’mica de estos receptores era desconocida. En la dŽcada de 1940 el farmac—logo Raymond Ahlquist, examinando las diferentes reacciones de —rganos a la adrenalina y sustancias qu’micas relacionadas, introdujo el concepto de la existencia de subtipos de receptores adrenŽrgicos (11): unos cuyo efecto principal es la contracci—n de cŽlulas de mœsculo liso vascular (receptores alfa-adrenŽrgicos) y otros que estimulan la contracci—n cardiaca (beta-adrenŽrgicos).
Posteriormente, cient’ficos como James Black (Premio Nobel de Fisiolog’a o Medicina en el a–o 1988) desarrollaron sustancias capaces de interferir con la acci—n de la adrenalina y la noradrenalina en el coraz—n, los denominados f‡rmacos beta-bloqueantes, que tuvieron una extraordinaria repercusi—n en el tratamiento de la enfermedad coronaria y la hipertensi—n.
A pesar de estos importantes progresos, a principios de los a–os 1960 exist’a todav’a un conocimiento muy escaso de las caracter’sticas moleculares de los receptores y de los mecanismos de transmisi—n de la se–al. En esta dŽcada se produjo un avance conceptual cr’tico, la teor’a del segundo mensajero (12) sugerida por Earl Sutherland (que obtuvo el Premio Nobel en el a–o 1971). Sutherland hab’a trabajado con el nobel Carl Cori estudiando los mecanismos por los que la adrenalina regula la degradaci—n de gluc—geno a glucosa en el h’gado. M‡s adelante descubri— que para promover este efecto la adrenalina no entra en la cŽlula sino que estimulaba la s’ntesis en el otro lado de la membrana de AMP c’clico (AMPc), tras la activaci—n de una enzima adenilil ciclasa.
El AMPc actœa entonces como Òsegundo mensajeroÓ transmitiendo la se–al a prote’nas intracelulares mediante la activaci—n de una prote’na quinasa dependiente de este nucle—tido c’clico, identificada por Edwin Krebs (13).
En el marco de la teor’a de la regulaci—n alostŽrica que hab’an propuesto en el a–o 1963 Monod, Changeux y Jacob, una hip—tesis muy atractiva era que la adenilil-ciclasa fuese una enzima alostŽrica de membrana con dos sitios diferentes, uno receptor en el exterior y otro catal’tico en el interior de la cŽlula. Sin embargo, los cient’ficos estadunidenses Martin Rodbell y Alfred Gilman demostraron en la dŽcada de los 70 y principios de los 80 del siglo pasado que la realidad era m‡s compleja, y que la actividad adenilil-ciclasa requer’a la presencia e hidr—lisis de GTP, y que exist’an unas prote’nas transductoras, denominadas prote’nas G, que actuaban como intermediarios entre el reconocimiento de la adrenalina por su receptor y la estimulaci—n de la actividad adenilil-ciclasa (14, 15). Estos cient’ficos compartieron el Premio Nobel de Fisiolog’a o Medicina en el a–o 1994.
En este contexto es en el que el trabajo de Robert Lefkowitz dio un impulso decisivo al entendimiento de la naturaleza y mecanismo de acci—n de los receptores de adrenalina. Lefkowitz, nacido en el a–o 1943 en el barrio de Bronx en Nueva York, se hab’a formado como cardi—logo en la Universidad de Columbia y hab’a realizado, tras un periodo de actividad cl’nica, una estancia postdoctoral en los Institutos Nacionales de la Salud con J. Roth e I. Pastan, trabajando en la identificaci—n de las acciones de la hormona ACTH utilizando ensayos de radioligandos.
Sin embargo, cuando se estableci— en la Universidad de Duke como investigador independiente en el a–o 1973, centr— sus esfuerzos en los receptores beta-adrenŽrgicos, quiz‡ por su formaci—n como cardi—logo y unido al hecho de que su padre hab’a fallecido recientemente a causa de una patolog’a cardiaca. Durante los siguientes a–os, el laboratorio de Lefkowitz desarroll— una seria de tŽcnicas que fueron esenciales para demostrar la existencia de los receptores como entidades moleculares diferenciadas, su cuantificaci—n, y posterior purificaci—n (Figura 3).
Figura 3.- Contribuciones esenciales del laboratorio de Lefkowitz en la identificaci—n del receptor de adrenalina y de los mecanismos de activaci—n de la adenilil-ciclasa.
La utilizaci—n de ligandos del receptor beta-adrenŽrgico marcados radioactivamente permiti— la detecci—n y cuantificaci—n del receptor en las membranas celulares (16). Posteriormente, los ensayos de uni—n de ligando en diferentes condiciones experimentales permitieron identificar interacciones alostŽricas complejas entre los receptores y las prote’nas G. As’, la afinidad de los ligandos por el receptor beta-adrenŽrgico pod’a modularse por la presencia de GTP, mientras que la presencia de un agonista aumentaba la interacci—n entre el receptor y la prote’na G. Estos experimentos llevaron a Lefkowitz, De Lean, Limbird y Stadel a proponer el denominado "modelo del complejo ternario", en el que el receptor activado unido a la prote’na G constitu’a el elemento estimulador de la actividad adenilil-ciclasa (17-19).
Otro paso esencial en la caracterizaci—n del receptor beta-adrenŽrgico fue su solubilizaci—n y purificaci—n. Con alguna excepci—n, como es la caso de la rodopsina en la retina, los receptores de membrana se encuentran generalmente en muy peque–as concentraciones, lo que dificulta mucho su aislamiento y purificaci—n. Gracias a la utilizaci—n de detergentes como la digitonina, Marc Caron y Lefkowitz consiguieron solubilizar un receptor funcional en el a–o 1976 (20).
A continuaci—n Marc Caron, desarroll— mŽtodos de cromatograf’a de afinidad basados en el antagonista beta-adrenŽrgico alprenolol, que permitieron la purificaci—n de los receptores purificados en columnas de alprenolol-sefarosa a principios de los a–os 80 (21,22). La disponibilidad del receptor purificado permiti— hacer un experimento conceptualmente cr’tico (23): Lefkowitz, en colaboraci—n con Eva Neer y Lutz Birnbaumer, realiz— experimentos de reconstituci—n de receptores purificados, prote’nas G purificadas y la actividad catal’tica de la adenilil-ciclasa, demostrando definitivamente que el mecanismo de transmisi—n de la se–al de adrenalina inclu’a tres entidades moleculares diferentes.
Clonaje del receptor beta-adrenŽrgico y el nacimiento de una familia de receptores de membrana
El propio Bob Lefkowitz ha recordado en entrevistas realizadas en los œltimos a–os que 1986 marc— un punto de inflexi—n cr’tico en su investigaci—n (24). En efecto, entonces tuvo lugar el paso decisivo de identificar el gen que codificaba para el receptor beta-adrenŽrgico, lo que permiti— tambiŽn conocer la secuencia y caracter’sticas de los aproximadamente 400 amino‡cidos que componen esa prote’na.
Ese proyecto lo lideraba en su laboratorio un postdoctoral de extraordinaria perseverancia y talento, llamado Brian Kobilka. Este investigador, nacido en Little Falls (Minnesota) en 1955 y formado tambiŽn como mŽdico cardi—logo en la Universidad de Yale, se hab’a incorporado como postdoctoral en la Universidad de Duke en el a–o 1984. La disponibilidad de receptor beta-2-adrenŽrgico purificado permiti— intentar el clonaje del gen y cDNA de este receptor utilizando tŽcnicas de microsecuenciaci—n pept’dica, para dise–ar luego oligonucle—tidos degenerados para intentar identificar el cDNA del receptor en genotecas de DNA gen—mico. DespuŽs de varios a–os de esfuerzo el grupo de Kobilka y Lefkowitz (en colaboraci—n con Cathy Strader en Merck) consigui— publicar la secuencia completa del receptor beta-2 adrenŽrgico de h‡mster en el nœmero de la revista Nature de mayo de 1986 (25). Sorprendentemente, el receptor de la adrenalina presentaba notables similitudes con el receptor de la luz (la rodopsina), en el sentido de que ambos parec’an presentar siete tramos de amino‡cidos capaces de atravesar la membrana celular (Figura 4).
Figura 4.- Clonaje del receptor beta adrenŽrgico y concepto de familia de receptores acoplados a prote’nas G. El conocimiento de la secuencia del receptor beta-2-adrenŽrgico permiti— su comparaci—n con la de la rodopsina e identificar similitudes en su estructura global y en la secuencia de sus dominios transmembrana, lo que permiti— proponer la existencia de una familia de receptores de 7 dominios transmembrana con similares rasgos estructurales.
Al mismo tiempo, el laboratorio de Lefkowitz tambiŽn descubri— que los mecanismos de regulaci—n del receptor de adrenalina eran muy parecidos a los de la rodopsina de la retina. Se hab’a descrito que en presencia de luz la rodopsina activada se fosforilaba en su dominio intracelular por una enzima denominada rodopsina quinasa, lo que promov’a su desensibilizaci—n. TambiŽn en 1986, Benovic, Mayor, Caron y Lefkowitz publicaron un art’culo en Nature (26) en el que identificaban que una quinasa similar, denominada quinasa del receptor beta adrenŽrgico (βARK por sus siglas en inglŽs) era capaz de fosforilar al receptor beta-2 adrenŽrgico en respuesta a adrenalina, y tambiŽn a la rodopsina en respuesta a la presencia de luz (Figura 5).
Figura 5.- Similitud entre los mecanismos de regulaci—n por fosforilaci—n de la rodopsina y del receptor beta-2 adrenŽrgico promovidos por la presencia de agonistas.
Se vislumbraba, por tanto, la emergencia de una "familia" de receptores para est’mulos externos muy diversos, pero que conservaba unos rasgos estructurales, de funcionamiento y de regulaci—n comœn: estaba naciendo lo que luego result— ser la gran familia de receptores acoplados a prote’nas G (GPCR), tambiŽn llamados por sus caracter’sticas estructurales receptores de siete dominios transmembrana, o receptores "serpentina".
En los siguientes a–os, el clonaje por el laboratorio de Lefkowitz de diversos subtipos de receptores adrenŽrgicos (revisado en 23 y 24), y de un receptor muscar’nico de acetil-colina por el grupo de Numa (27) corrobor— la idea de la existencia de una gran familia de receptores relacionados estructural y funcionalmente.
Por otra parte, Lefkowitz y Kobilka realizaron experimentos con receptores quimŽricos que combinaban secuencias de receptores alfa-2 y beta-2 adrenŽrgicos que fueron muy relevantes para identificar dominios intracelulares del receptor implicados en la interacci—n con subtipos de prote’nas G espec’ficos (28). TambiŽn el grupo de Lefkowitz, con especial protagonismo de su colaborador J.L. Benovic, desarroll— a finales de la dŽcada de 1980 y en la dŽcada de 1990 la caracterizaci—n en detalle de los mecanismos de regulaci—n de GPCRs por las prote’nas GRKs y arrestinas, abriendo nuevos perspectivas sobre el funcionamiento y los mecanismos de se–alizaci—n de esta familia de prote’nas (29, 30).
5. Desvelando la estructura tridimensional de los receptores acoplados a prote’nas G.
A pesar del inmenso progreso que supon’an estos nuevos avances, persist’an algunas preguntas clave: Àc—mo y d—nde se unen los ligandos de GPCRs de forma espec’fica? Àc—mo se transmite la se–al y se promueve la activaci—n de las prote’nas G? La respuesta a estas preguntas requiri— de nuevos experimentos bioqu’micos y biof’sicos y, muy particularmente, precisaba dilucidar la estructura cristalina de estos receptores.
Tras trasladarse a la Universidad de Stanford (California) en 1989, Brian Kobilka se propuso un reto que tard— casi 20 a–os en alcanzar: determinar la estructura en el espacio de esos receptores. Este proyecto presentaba algunos retos muy dif’ciles de resolver: los GPCRs son prote’nas de membrana de poca abundancia relativa y son prote’nas muy din‡micas, capaces de adoptar diversas conformaciones, as’ como altamente inestables en detergentes, presentando poca exposici—n de superficies hidrof’licas. Todo ello supon’a un autŽntico reto a la hora de intentar su cristalizaci—n.
Para hacer frente a estas dificultades el grupo de Brian Kobilka en colaboraci—n con investigadores como Gebhard Schertler y Raymond Stevens desarrollaron diversas soluciones alternativas (31-33), que incluyeron el desarrollo de sistemas de expresi—n de alto rendimiento de receptores recombinantes en baculovirus, la utilizaci—n de nuevos detergentes, la co-cristalizaci—n de receptores con antagonistas o agonistas inversos capaces de estabilizar conformaciones espec’ficas del receptor; el incremento del ‡rea hidrof’lica de los receptores para facilitar la cristalizaci—n mediante la fusi—n con fragmentos tipo FAb o ÒnanobodiesÓ o con T4 lisozima, la utilizaci—n de mutantes de receptores con mayor estabilidadÉ
Todo ello permiti— publicar en el a–o 2007 la primera estructura del receptor beta2-adrenŽrgico unido al antagonista carazolol (31). Este avance facilit— tambiŽn la comparaci—n detallada con las estructuras tridimensionales de la rodopsina que, gracias a su mayor abundancia y facilidad de purificaci—n, se hab’an obtenido por diversos autores particularmente Krzystztof Palczewski y Okada alrededor del a–o 2000 (34,35).
Estos progresos en la "ingenier’a" de GPCRs y su cristalograf’a han permitido un avance acelerado en los œltimos a–os en el conocimiento de nuevas estructuras. A finales del a–o 2012 se hab’an obtenido 16 estructuras de GPCRs, 9 de ellas publicadas en el propio a–o 2012 (revisado en referencia 36) . Entre estas estructuras se incluyen las de los receptores beta-1 adrenŽrgicos, muscar’nicos tipo M2 y M3, el receptor H1 de histamina, el receptor D3 de dopamina, el receptor tipo A2a de adenosina, el receptor de esfingosina 1 fosfato S1P1, el receptor de quimioquinas CXCR4, tres subtipos de receptores de opi‡ceos (OPRK1, OPRM1, OPRD1), el receptor de nociceptina OPRL1, as’ como receptores de neurotensina y el receptor de proteasas PAR1 (36,37). Adem‡s, algunos de ellos han sido co-cristalizados en complejo con diferentes ligandos, lo que ha permitido investigar los cambios conformacionales relacionados con la uni—n de diversos compuestos qu’micos.
La obtenci—n de estas diversas estructuras ha permitido conocer con precisi—n los dominios de receptores implicados en la interacci—n con sus ligandos espec’ficos y las similitudes y diversidades estructurales presentes en los dominios extracelulares, transmembrana, e intracelular de los diversos GPCRs (revisado en detalle en las referencias 36 y 37).
La œltima frontera en este conocimiento de la estructura tridimensional de los receptores ha sido la identificaci—n de los cambios estructurales que tienen lugar tras la activaci—n del receptor y que conducen a la estimulaci—n de las prote’nas G. Para ello una vez mas ha sido decisiva la aportaci—n de Brian Kobilka, publicada en dos art’culos sucesivos en la revista Nature el 29 de septiembre del a–o 2011 (38,39).
En estos trabajos su grupo describi— la cristalizaci—n de un receptor beta-2 adrenŽrgico activado por agonista en complejo con la prote’na Gαs. Experimentos de una gran complejidad tŽcnica, que incluyen la ingenier’a de estas prote’nas para favorecer la estabilizaci—n de ese complejo, han permitido identificar las superficies de interacci—n y los principales cambios estructurales que tienen lugar en las diversas prote’nas del complejo (Figura 6).
En el caso del receptor beta-2 adrenŽrgico, el cambio conformacional m‡s significativo incluye un movimiento hacia el exterior del extremo citopl‡smico del segmento transmembrana 6 y una extensi—n en alfa-hŽlice del extremo citopl‡smico del segmento transmembrana 5. Estos dos movimientos coordinados permiten la separaci—n de los bucles intracelulares 2 y 3 de la estructura del receptor y la creaci—n de un ÒbolsilloÓ hidrof—bico donde puede unirse la prote’na Gαs (Figura 6). En concreto, la inserci—n en de la hŽlice α5 C-terminal de Gαs en esta hendidura hidrof—bica transitoria formada en el receptor activado por agonista permite a su vez cambios importantes en la estructura de la prote’nas G, mediante la rotaci—n de su dominio GTPasa y el remodelado de la regi—n β6–α5, lo que facilitar’a la liberaci—n de GDP y el consiguiente paso de la prote’na G a su estado activo.
Figura 6.- Estructura tridimensional del receptor beta-2 adrenŽrgico y cambios promovidos tras su activaci—n. Los trabajos de Kobilka han permitido cristalizar el receptor beta-2-adrenŽrgico activado por agonista en complejo con la prote’na G e identificar las principales superficies de interacci—n entre estas prote’nas. En el esquema de la derecha se muestran los principales cambios conformacionales promovidos por agonistas, que conducen a un aumento de las superficies hidrof—bicas que se ofrecen a las prote’nas G en el interior de la cŽlula (esquema modificado de www.nobel.org).
En definitiva, todos estos estudios est‡n permitiendo obtener informaci—n muy relevante sobre las distintas conformaciones activas de los GPCRs y sobre c—mo son capaces de transmitir informaci—n al interior de la cŽlula. El concepto general que parece emerger es que la familia de receptores de 7 dominios transmembrana tendr’a una arquitectura general modular, compuesta por un m—dulo de uni—n de ligandos y otro m—dulo de se–alizaci—n hacia el interior celular (Figura 7).
El m—dulo de uni—n de ligandos, formado por las bucles extracelulares del receptor y la parte m‡s externa de sus dominios transmembrana, presenta la mayor diversidad entre los distintos receptores GPCR (lo que permitir’a explicar su interacci—n espec’fica con mœltiples ligandos diferentes) y sufre cambios conformacionales menos acusados en presencia de agonistas (37). Por el contrario, el modulo de se–alizaci—n hac’a el interior de la cŽlula, formado por la parte m‡s interna de los dominios transmembrana y por los bucles intracelulares del receptor, presenta menor diversidad entre las subfamilias de GPCRs y sufre cambios conformaciones muy evidentes tras la llegada de los ligandos, permitiendo as’ la transmisi—n de la se–al al interior de la cŽlula (37). El hecho de que este œltimo m—dulo sea m‡s conservado es tambiŽn coherente con el hecho de que 800 receptores para sustancias diferentes puedan converger en la interacci—n con las mismas prote’nas G, o ser regulados por las mismas familias de quinasas GRKs y de arrestinas.
Figura 7.- Arquitectura modular de la familia de receptores acoplados a prote’nas G Los GPCR se estructuran en dos m—dulos con distintos grados de divergencia de secuencia y de movilidad conformacional (esquema inspirado en la referencia 37).
6. Perspectivas futuras
La concesi—n del Nobel de Qu’mica a Lefkowitz y Kobilka completa justamente el reconocimiento que en a–os precedentes se hab’a ido otorgando a los otros descubridores de pautas esenciales de este lenguaje de comunicaci—n celular (Earl Sutherland, premio Nobel 1971 por identificar por primera vez el AMPc como segundo mensajero y Al Gilman y Martin Rodbell, premio Nobel 1994 por su descubrimiento de las prote’nas G). Sin embargo, hay todav’a muchos interrogantes abiertos en este campo.
Entre ellos, cabe destacar las nuevas v’as de se–alizaci—n de receptores de 7 dominios transmembrana consecuencia de su interacci—n con las prote’nas GRKs y arrestinas. Estas prote’nas no solamente actuar’an como reguladores negativos del acoplamiento de los GPCR a las prote’nas G (que es como fueron identificados), sino que presentan complejos interactomas que les permiten tambiŽn participar en la propagaci—n de la se–al de estos receptores tras la llegada de un agonista (30,40). Esta divergencia de se–alizaci—n de los receptores de 7 dominios transmembrana entre v’as dependientes de prote’nas G y otras cascadas dependientes de GRKs y arrestinas ha llevado tambiŽn a la identificaci—n de los que se ha denominado Òbiased ligandsÓ, sustancias qu’micas que de manera preferente inducen la interacci—n del receptor bien con prote’nas G, bien con GRKs/arrestinas, lo que puede tener un gran interŽs para el desarrollo de nuevos f‡rmacos. En este mismo sentido, el mejor conocimiento de los ÒbolsillosÓ de uni—n de ligandos a los GPCRs facilitar‡ el dise–o de nuevos compuestos qu’micos con mayor afinidad y/o selectividad (4,36,37).
Por otra parte, se est‡ identificando la existencia de GPCRs codificados por diversos virus, que podr’an tener un papel relevante en su capacidad patogŽnica y constituir potenciales dianas para su tratamiento.
Por œltimo, la secuenciaci—n del genoma humano ha puesto de manifiesto la presencia en nuestra informaci—n genŽtica de mœltiples miembros de la familia de receptores 7 dominios transmembrana sin mensajero fisiol—gico conocido (los denominados GPCRs huŽrfanos), lo que presenta el importante reto de identificar sus ligandos end—genos y sus funciones fisiol—gicas e implicaciones patol—gicas.
En definitiva, el camino abierto con extraordinaria clarividencia y perseverancia por Lefkowitz y Kobilka, seguido actualmente por much’simos otros investigadores, permitir‡ seguir conociendo mejor las alteraciones de receptores en situaciones patol—gicas y avanzar en el dise–o de nuevas estrategias terapŽuticas. Hay aœn mucho trabajo por hacer y muchas preguntas por contestar.
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El Premio Nobel en Fisiolog’a o Medicina 2012: Rebobinando la pel’cula genŽtica del desarrollo
Juan Ram—n Lacadena
AcadŽmico de Nœmero de la Real Academia Nacional de Farmacia.
e-mail: edicion@ranf.com
Recibido el 18 de febrero de 2013 An. Real Acad. Farm. Vol 79, N¼ 1 (2013), pag. 151-171.
RESUMEN
En el presente trabajo se glosan las investigaciones sobre reprogramaci—n celular llevadas a cabo mediante transferencia nuclear de cŽlulas som‡ticas y la obtenci—n de cŽlulas troncales pluripotentes inducidas (iPS). |
Palabras clave: Reprogramaci—n celular; Transferencia nuclear; CŽlulas troncales pluripotentes inducidas; cŽlulas iPS.
ABSTRACT
Rewinding the genetic film of development
Investigations on cell reprogramming carried out by cell nuclear transfer and the induction of somatic pluripotent stem cells (iPS) in mammals awarded the Nobel Prize in Phisiology or Medicine 2012 are analyzed. |
Keywords: Cell reprogramming; Nuclear transfer; Induced pluripotent stem cells; iPS cells.
1. Introducci—n
El 8 de octubre de 2012 se hac’a pœblico que la Asamblea Nobel del Instituto Karolinska hab’a concedido el Premio Nobel en Fisiolog’a o Medicina 2012 a los Dres. Sir John B. Gurdon (Gurdon Institute, Universidad de Cambridge, UK) y Shinya Yamanaka (Universidad de Kyoto, Jap—n) Òpor el descubrimiento de que cŽlulas maduras [diferenciadas] pueden ser reprogramadas para convertirse en pluripotentesÓ. Perm’taseme recordar aqu’ que en el discurso inaugural del a–o 2011 que tuve el honor de pronunciar en esta Real Academia recog’ las siguientes palabras en el apartado correspondiente a las cŽlulas troncales pluripotentes inducidas: ÒEl hecho de que Yamanaka junto con Gurdon recibieran en 2009 el Premio Albert Lasker de Investigaci—n B‡sica en Medicina puede ser una anticipaci—n de que, antes o despuŽs, recibir‡n el merecido premio NobelÓ. No tard— dos a–os en cumplirse mi profec’a.
En la concesi—n de un premio Nobel puede premiarse una investigaci—n pionera en un campo cient’fico o una investigaci—n posterior basada en el cambio de paradigma que supuso aquella. En el caso que hoy nos ocupa, la Asamblea Nobel ha tenido el acierto de premiar ambas cosas: por un lado, a Sir John B.Gurdon que hace 50 a–os, en 1962, demostr— la posibilidad de que la informaci—n genŽtica contenida en el nœcleo de cŽlulas diferenciadas de un anfibio pudiera ser reprogramada para reiniciar un proceso de desarrollo completo y, por otro lado, a Shinya Yamanaka que 44 a–os m‡s tarde encontr— las claves genŽticas para inducir la reprogramaci—n celular en mam’feros como el rat—n y el ser humano
2. CONCEPTO GENƒTICO DE DESARROLLO
El desarrollo se puede definir como un Òproceso regulado –es decir, bajo control genŽtico– de crecimiento y diferenciaci—n resultante de la interacci—n nœcleo-citopl‡smica, del ambiente celular interno y del medio externo mediante el cual se produce la formaci—n del individuo adulto a partir de una cŽlula inicial œnica: el cigoto originado por la fecundaci—n de los gametosÓ. El cigoto reœne la informaci—n genŽtica necesaria (aunque a veces no suficiente) para programar la formaci—n del nuevo ser, de manera que, de no mediar alteraciones de cualquier tipo que interfieran con el proceso, a partir del momento en que empiece a funcionar el primer gen en dicha cŽlula, la programaci—n genŽtica conducir‡ inexorablemente a la formaci—n del individuo adulto. El proceso de desarrollo es, por tanto, una secuencia programada de cambios fenot’picos controlados espacial y temporalmente que constituyen el ciclo vital del organismo (1).
En el proceso global de desarrollo cabe distinguir los siguientes fen—menos o componentes del desarrollo:
á La replicaci—n genŽtica (ADN) y la proliferaci—n celular, que producen el crecimiento;
á La diferenciaci—n celular o citodiferenciaci—n, fen—meno por el cual cŽlulas que tienen un origen comœn y, por tanto, son genŽticamente idŽnticas, divergen en su estructura y/o funci—n, dando lugar a l’neas celulares morfol—gicamente y/o fisiol—gicamente diferentes;
á La histogŽnesis, como resultado de la agregaci—n de cŽlulas diferenciadas para constituir un tejido con funci—n especializada;
á La organogŽnesis, como consecuencia de la asociaci—n de tejidos, dando como resultado final la forma del individuo (morfogŽnesis);
á Por œltimo, podr’a considerarse el comportamiento como una expresi—n multidimensional del desarrollo.
En el contexto del Premio Nobel que conmemoramos, solamente haremos referencia a la diferenciaci—n celular. La citodiferenciaci—n es debida a una actividad gŽnica diferencial determinada por causas ambientales intra o extra celulares aunque en algunas ocasiones pueda ser producida por o ir acompa–ada de modificaciones cromos—micas estables (numŽricas, estructurales o fisiol—gicas) de la dotaci—n cromos—mica de las cŽlulas. La cuesti—n fundamental que se plantea es si las cŽlulas diferenciadas conservan la capacidad (multipotencia o pluripotencia) de originar un tejido u —rgano diferente al que estaban programadas o a un organismo completo (totipotencia), comport‡ndose como un verdadero cigoto si las condiciones experimentales las indujeran a ello.
3. REPROGRAMACIîN NUCLEAR
Desde el punto de vista genŽtico, por reprogramaci—n nuclear se entiende el cambio en la expresi—n gŽnica de una clase de cŽlula a otro tipo de cŽlula no relacionada con ella. Como se–alaban Gurdon y Melton (2), las primeras evidencias experimentales sobre reprogramaci—n se obtuvieron en las dŽcadas de los 50 y 60 del siglo pasado con los trabajos sobre clonaci—n en anfibios. A partir de ah’ habr’a que tener en cuenta las tŽcnicas de clonaci—n por transferencia nuclear de cŽlulas som‡ticas en mam’feros (SCNT, somatic cell nuclear transfer), la fusi—n celular, las cŽlulas troncales embrionarias y adultas, la inducci—n de pluripotencia por expresi—n gŽnica ect—pica (cŽlulas iPS, induced pluripotent stem cells) y la reprogramaci—n directa que permite transformar un tipo de cŽlula diferenciada en otra cŽlula diferenciada (transdiferenciaci—n) sin pasar por la fase intermedia equivalente de una cŽlula pluripotente. Lo mismo que en la Edad Media los alquimistas trataban de transmutar en oro a otros metales, en la actualidad estamos viviendo una nueva clase de alquimia -la alquimia celular (3)- que convierte una cŽlula en otro tipo de cŽlula.
El Premio Nobel en Fisiolog’a o Medicina 2012 que hoy conmemoramos tiene que ver con la clonaci—n por transferencia de nœcleos (Gurdon) y con la inducci—n de cŽlulas troncales pluripotentes (Yamanaka).
4. LA CLONACIîN POR TRANSFERENCIA DE NòCLEOS
4.1. Anfibios
En la dŽcada de los cincuenta del siglo pasado, Briggs y King (4) trasplantaron nœcleos de cŽlulas de bl‡stula, g‡strula, nŽurula y renacuajo de Rana pipiens a citoplasmas de —vulos sin fecundar que hab’an sido enucleados mediante micro manipulaciones para comprobar si tales nœcleos eran capaces de dar marcha atr‡s en su proceso informativo y volver a dar un desarrollo normal. Los resultados obtenidos mostraron que al trasplantar nœcleos del estadio de bl‡stula se obten’a un desarrollo normal, mientras que al trasplantar los nœcleos de cŽlulas de g‡strula, nŽurula o renacuajo disminu’a de forma progresiva la capacidad de desarrollo. La conclusi—n evidente era que cuanto m‡s diferenciadas estaban las cŽlulas donantes de los nœcleos ten’an menos capacidad de desarrollo total (totipotencia).
Sin embargo, diez a–os despuŽs del primer experimento de Briggs y King, en 1962 John B. Gurdon (5) hizo un experimento que le ha valido el Premio Nobel sesenta a–os m‡s tarde, porque su investigaci—n cambi— la idea de que la diferenciaci—n celular era un proceso irreversible, sentando las bases para el desarrollo posterior de las tŽcnicas de reprogramaci—n nuclear, tanto en la obtenci—n de mam’feros cl—nicos como en la obtenci—n de cŽlulas troncales, de especial importancia en la Biomedicina.
Los experimentos de Gurdon consistieron en transferir el nœcleo de una cŽlula diferenciada (cŽlula ciliada epitelial de intestino) de renacuajo del sapo con garras africano (Xenopus laevis) al citoplasma de un —vulo cuyo nœcleo hab’a sido destruido mediante radiaci—n ultravioleta, obteniendo un sapo macho y otro hembra normales, aunque con una frecuencia peque–a (1%).
Como comprobaci—n experimental de que la tŽcnica de transferencia nuclear hab’a sido correcta, Gurdon utiliz— como cepa donadora del nœcleo un mutante nucleolar obtenido por Fischberg (6), en cuyo laboratorio hab’a trabajado con anterioridad, que mostraba en el nœcleo interf‡sico un solo nucleolo en lugar de dos que ten’a la cepa receptora normal. Diez a–os m‡s tarde, Kobel y colaboradores (7) obtuvieron un sapo hembra fŽrtil transfiriendo nœcleos de cŽlulas no ciliadas de epidermis de renacuajo, ratificando as’ las experiencias de Gurdon.
A pesar de la evidencia experimental aportada por Gurdon y la corroboraci—n por Kobel y colaboradores, sin embargo la clonaci—n en anfibios por transferencia de nœcleos de cŽlulas diferenciadas fue recibida con cierto escepticismo por parte de la comunidad cient’fica (8) porque, como se–ala la propia Instituci—n Nobel, el descubrimiento de Gurdon Òhizo a–icos el dogma de que la diferenciaci—n celular s—lo pod’a ser un proceso unidireccionalÓ (9).
De hecho, la idea cient’fica vigente entonces estaba muy enraizada con el modelo de canalizaci—n del desarrollo propuesto por Waddington en 1957 (10) en la dŽcada anterior en el que comparaba el proceso de desarrollo con un paisaje epigenŽtico de monta–as y valles en el que las cŽlulas indiferenciadas est‡n en las cumbres de las monta–as y en el proceso de diferenciaci—n entran en los valles de forma que ya no podr‡n volver al estado diferenciado que representan las cumbres.
Otro ejemplo muy gr‡fico que sol’a utilizar yo en mis clases de GenŽtica era el de los cambios de v’a de una estaci—n de tren donde se clasificaban los vagones llev‡ndolos a las v’as muertas del la diferenciaci—n.
4.2. Mam’feros
Si en anfibios hab’a sido posible la clonaci—n por transferencia de nœcleos, Àpor quŽ no pod’a ser posible tambiŽn en mam’feros? Sin embargo, las investigaciones realizadas inicialmente en ratones dieron resultados negativos, dando pie a que se llegara a decir en palabras del mayor exponente en el campo de la investigaci—n genŽtica embriol—gica en rat—n de aquella Žpoca que Òla clonaci—n por transferencia de nœcleos en mam’feros es biol—gicamente imposibleÓ (11).
Es obvio que tŽrminos como imposible, siempre o nunca no pueden ser usados en cuestiones cient’ficas. De hecho, trece a–os m‡s tarde, en 1997, la comunidad cient’fica y la sociedad conocieron con perplejidad que en el Instituto Roslin de Edimburgo hab’a nacido la oveja Dolly originada por transferencia del nœcleo de una cŽlula de gl‡ndula mamaria de una oveja adulta a un ovocito enucleado en una investigaci—n dirigida por el Dr. Ian Wilmut (12). Este trabajo del grupo de Wilmut abri— las puertas a la clonaci—n por transferencia de nœcleos en mam’feros; as’, hasta la fecha de hoy, se han obtenido animales cl—nicos en otras muchas especies: rat—n, vaca, mono rhesus, cabra, cerdo, gato, conejo, carnero ÒbatengÓ, mulo, caballo, rata, ciervo, perro, lobo, camello, toro de lidia, coyote. Cuando se conoci— la noticia del nacimiento de la oveja Dolly, un peri—dico hac’a un comentario con el titular Òhoy la oveja, ma–ana el pastorÓ planteando el problema Žtico que supondr’a obtener humanos cl—nicos.
Como ha ocurrido en otras ocasiones, en el camino de la concesi—n de este Premio Nobel en Fisiolog’a o Medicina 2012 ha habido algœn damnificado: me refiero al Dr. Ian Wilmut (Roslin Institute, Universidad de Edimburgo, UK) y a su colaborador el Dr. Keith Kampbell −fallecido unos d’as antes de la concesi—n del premio por lo que no hubiera podido recibir el galard—n segœn las normas de la instituci—n Nobel− que muy bien podr’a haber compartido el premio con el Dr. Gurdon reconociendo su mŽrito por la clonaci—n de la oveja Dolly que abri— las puertas a la clonaci—n en mam’feros.
5. CƒLULAS TRONCALES PLURIPOTENTES INDUCIDAS (IPS) (13)
5.1. CŽlulas troncales
La terapia celular, basada en la transferencia de cŽlulas o tejidos a los tejidos u —rganos da–ados, es una de las grandes esperanzas de la Medicina Regenerativa del futuro. El establecimiento de cultivos celulares de tejidos humanos en el laboratorio es a veces muy dif’cil. Por ello, desde el punto de vista cl’nico es innegable el avance que supondr’a la posibilidad de poner a punto tŽcnicas que permitieran obtener cualquier tipo de cultivos de tejidos y, acaso en un futuro m‡s lejano, de —rganos. En este contexto, no cabe duda que el uso de las cŽlulas troncales. puede resultar fundamental.
Por cŽlula troncal se entiende cualquier cŽlula indiferenciada que tiene la doble capacidad de dividirse de forma ilimitada y, en un cierto momento, diferenciarse dando lugar a diferentes tipos de cŽlulas especializadas. De acuerdo con esta segunda capacidad, las cŽlulas troncales pueden ser totipotentes, pluripotentes y multipotentes en raz—n a su mayor o menor versatilidad o potencialidad, tal como se definen a continuaci—n:
á CŽlula totipotente: CŽlula troncal que tiene la capacidad de diferenciarse en el embri—n y en tejidos y membranas extraembri—nicas. Las cŽlulas totipotentes contribuyen a todos los tipos celulares de un organismo adulto. La totipotencia es la capacidad funcional de una cŽlula de dar lugar a un individuo completo tras un proceso de desarrollo normal. Las cŽlulas totipotentes de un embri—n muy temprano tienen la capacidad de diferenciarse en membranas y tejidos extraembri—nicos, en el embri—n y en todos los tejidos y —rganos postembri—nicos. En el embri—n humano, parece ser que solamente son totipotentes los blast—meros hasta el estadio de m—rula de 16 cŽlulas.
á CŽlula pluripotente: CŽlula troncal presente en los estadios tempranos de desarrollo embrionario (blastocisto) que puede generar todos los tipos de cŽlulas en el feto y en el adulto y es capaz de autorrenovaci—n. Las cŽlulas pluripotentes, sin embargo, no son capaces de desarrollarse en un organismo completo. La pluripotencia es la capacidad funcional de una cŽlula de dar lugar a varios linajes celulares o tejidos diferentes. Las cŽlulas troncales embrionarias (ES) presentes en la masa celular interna (MCI) del blastocisto humano son pluripotentes, pero no totipotentes; es decir, pueden originar distintos tejidos u —rganos pero no dar lugar al desarrollo completo de un embri—n porque no pueden producir las membranas y tejidos extraembri—nicos necesarios para el proceso de gestaci—n. No obstante, podr’a ocurrir que una cŽlula pluripotente de la masa celular interna se convirtiera en totipotente.
á CŽlula multipotente: CŽlula troncal presente en los tejidos u —rganos adultos que tiene una capacidad limitada de reactivar su programa genŽtico como respuesta a determinados est’mulos que le permiten dar lugar a algunos, pero no todos, los linajes celulares diferenciados. La multipotencia es la capacidad funcional de una cŽlula de dar lugar a alguno, pero no todos, los linajes celulares. Algunas cŽlulas troncales presentes en tejidos u —rganos adultos son multipotentes. A veces se utiliza el tŽrmino plasticidad como equivalente a multipotencia.
Hay varias clases de cŽlulas troncales (embrionarias, adultas, pluripotentes inducidas) cuya eficacia en el establecimiento de cultivos de tejidos en el laboratorio y sus valoraciones Žticas y jur’dicas son diferentes. Aunque los tres tipos de cŽlulas troncales pueden tener una aplicaci—n cl’nica, sin embargo las cŽlulas iPS son especialmente indicadas en la terapia celular de la Medicina Regenerativa porque al tratarse de una transferencia aut—loga se evita el rechace inmunol—gico. En el presente contexto œnicamente se har‡ referencia a las cŽlulas troncales pluripotentes inducidas (cŽlulas iPS).
5.2. CŽlulas roncales pluripotentes inducidas (iPS), una esperanza Žtica para el futuro (14)
CŽlulas iPS de rat—n
Desde el a–o 2003, el laboratorio de Yamanaka (15) estaba interesado en el estudio de los factores necesarios para mantener la pluripotencia de las cŽlulas troncales embrionarias, identificando el gen Nanog (16) a la vez que lo hac’a el grupo de Austin Smith (17). A partir de entonces decidi— investigar la posibilidad de inducir la pluripotencia en cŽlulas som‡ticas. Conociendo el trabajo de Tada y colaboradores (18) del a–o 2001 en el que demostraron que la fusi—n de cŽlulas som‡ticas con cŽlulas ES induce la pluripotencia del nœcleo som‡tico, Yamanaka seleccion— un conjunto de 24 factores de transcripci—n como posibles candidatos para inducir la pluripotencia en cŽlulas som‡ticas, descartando uno a uno los factores que no parec’an capacitados para ello.
Finalmente, en 2006 Yamanaka (19), logr— la reprogramaci—n de cŽlulas som‡ticas de rat—n utilizando solamente cuatro genes reguladores de la transcripci—n (Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4) que fueron capaces de convertir fibroblastos embri—nicos de rat—n en cŽlulas troncales pluripotentes, por lo que se le puede acreditar la paternidad de la tŽcnica (20) que fue ratificada por el grupo de investigaci—n de Rudolf Jaenisch (21). Posteriormente, Yamanaka refin— la tŽcnica original (22). En 2009, Mar’a Blasco y colaboradores demostraron que es necesaria la presencia de la actividad telomerasa en la obtenci—n de cŽlulas iPS en rat—n (23).
Pensando en una futura aplicaci—n cl’nica de estas tŽcnicas hay que se–alar dos inconvenientes: en primer lugar, la utilizaci—n de un retrovirus como vector para introducir los genes reguladores que reprograman las cŽlulas som‡ticas y, en segundo lugar, en el caso de Yamanaka, la utilizaci—n del proto-oncogŽn c-Myc, lo cual puede suponer un obst‡culo para lograr la autorizaci—n para llevar a cabo la investigaci—n cl’nica. De hecho, un 20% de los ratones implantados con cŽlulas iPS desarrollaron teratomas cancerosos. M‡s tarde, en 2011, Yamanaka y colaboradores (24) obten’an cŽlulas iPS a partir de fibroblastos de rat—n y humanos sustituyendo el factor c-Myc por el factor de transcripci—n Glis1 (de la familia de zinc finger 1), evitando el posible efecto da–ino del proto-oncogŽn c-Myc. El factor Glis 1 promueve mœltiples v’as de reprogramaci—n, tales como las Myc, Nanog, Lin28, Wnt, Essrb y la transici—n mesenquima-epitelial.
Para obviar estas dificultades cl’nicas se han introducido algunas mejoras tŽcnicas: por ejemplo, Yamanaka y colaboradores (25) han obtenido las cŽlulas iPS sin utilizar vectores virales en ratones. Para ello utilizaron la transfecci—n repetida de dos pl‡smidos de expresi—n en fibroblastos de embriones, uno era portador de los ADNc (ADN complementario) de Oct3/4, Sox2 y Klf4 y el otro del de c-Myc. En las cŽlulas iPS obtenidas no se produjo la integraci—n del pl‡smido en el genoma, evitando la formaci—n de teratomas.
Por su parte, Jaenisch y colaboradores (26), con objeto de reducir el nœmero de part’culas virales necesarias para la reprogramaci—n y por tanto disminuir el peligro de la mutagŽnesis inducida por la integraci—n de ADN viral en el genoma, lograron que los cuatro factores de reprogramaci—n Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc pudieran ser expresados a partir de un œnico promotor viral, generando cŽlulas iPS tanto a partir de cŽlulas embrionarias o adultas de rat—n como a partir de queratinocitos humanos.
Por otro lado, Melton y colaboradores (27) obtuvieron cŽlulas iPS a partir de fibroblastos humanos utilizando solamente los factores Oct4 y Sox2, evitando la presencia de los proto-oncogenes Klf4 y c-Myc y sus posibles efectos da–inos. Incluso, m‡s tarde, Schšler y colaboradores (28) demostraron que la presencia œnica del gen Oct4 bastaba para obtener cŽlulas iPS (que denominan 1FiPS) a partir de cŽlulas troncales neuronales de rat—n adulto.
Un nuevo avance en el tema de la cŽlulas iPS se produjo en abril de 2009 cuando Ding y colaboradores (29) lograron transformar cŽlulas som‡ticas de rat—n en cŽlulas troncales pluripotentes inducidas (iPS) sin introducir en las cŽlulas informaci—n genŽtica alguna sino, simplemente, poniendo a las cŽlulas en presencia de determinadas prote’nas.
CŽlulas iPS humanas
El paso a la obtenci—n de cŽlulas troncales pluripotentes inducidas en la especie humana la realizaron casi simult‡neamente el grupo de Yamanaka y el de Thomson. En 2007, Thomson y colaboradores (30) lograron reprogramar cŽlulas som‡ticas adultas humanas (procedentes de prepucio de reciŽn nacido y de piel de feto) y convertirlas en cŽlulas troncales pluripotentes, introduciendo en ellas mediante un vector viral cuatro genes (Oct4, Sox2, Nanog y Lin28) que regulan la transcripci—n (factores de transcripci—n). Estas cŽlulas troncales pluripotentes inducidas (cŽlulas iPS, induced pluripotent stem cells) tienen cariotipo normal, expresan actividad telomerasa, expresan marcadores celulares de superficie y genes que caracterizan a las cŽlulas troncales embrionarias (ES) y mantienen el potencial de desarrollo para diferenciarse en cŽlulas de las tres capas germinales primarias. La eficacia de la tŽcnica es de una cŽlula iPS obtenida por cada 10.000 cŽlulas tratadas que, en tŽrminos pr‡cticos, es muy alta.
La publicaci—n del trabajo del grupo de Thomson fue simult‡nea con la del grupo de Shinya Yamanaka (31) quienes utilizando como vector un retrovirus introdujeron en cŽlulas som‡ticas humanas (cŽlulas de la piel de la cara de una mujer de 36 a–os y de tejido conectivo sinovial de un var—n de 69 a–os) cuatro genes reguladores de la transcripci—n (Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4) con una eficacia de una cŽlula troncal pluripotente inducida (iPS) obtenida por cada 5.000 cŽlulas de piel utilizadas en el tratamiento. Por su parte, Izpisœa Belmonte y su grupo (32) mostraron que la utilizaci—n de queratinocitos de cabello humano resultaba cien veces m‡s eficaz y era el doble de r‡pido que cuando se utilizaban fibroblastos.
Como se ha indicado anteriormente, Melton y colaboradores obtuvieron en 2008 cŽlulas iPS a partir de fibroblastos humanos utilizando solamente los factores Oct4 y Sox2, evitando la presencia de los proto-oncogenes Klf4 y c-Myc y sus posibles efectos da–inos.
En noviembre de 2010, Rossi y colaboradores (33) obtuvieron cŽlulas iPS a partir de varios tipos de cŽlulas humanas mediante ARNm sintŽtico modificado (RiPS cells), evitando los peligros de los mŽtodos integrativos de ADN (vectores virales) y logrando superar la eficacia de otros mŽtodos dise–ados anteriormente (por ejemplo, uso de prote’nas). Ellos sintetizaron ARN modificado correspondiente a los cuatro factores de transcripci—n can—nicos utilizados inicialmente por Yamanaka: Klf4, c-Myc, Oct4 y Sox2 y en un experimento posterior a–adieron el ARN modificado correspondiente a un quinto factor (Lin28 de Thomson). Los mŽtodos utilizados no son mutagŽnicos y son altamente controlables. Adem‡s, la utilizaci—n de ARN modificado plantea la posibilidad de utilizar esta nueva tecnolog’a para dirigir la diferenciaci—n de las cŽlulas iPS obtenidas (RiPS) en el tipo celular deseado. Por ejemplo, los mismos autores, utilizando ARN sintŽtico modificado que codificaba para el factor de transcripci—n miogŽnico MYOD, obtuvieron cŽlulas miogŽnicas que originaban miotubos formados por miogenina y miosina.
Aplicaci—n terapŽutica en modelo experimental de rat—n
En diciembre de 2007, el grupo de Jaenisch hizo pœblico en la revista Science el Žxito de la aplicaci—n en ratones de la tŽcnica de Yamanaka para el tratamiento de la anemia falciforme humana en un modelo de rat—n utilizando cŽlulas pluripotentes inducidas (iPS) mediante reprogramaci—n de cŽlulas de la piel (34). Posteriormente, en 2009, Ward, Ma y colaboradores (35) lograron corregir tambiŽn en ratones la hemofilia de tipo A (producida por mutaci—n del factor VIII) de manera que al inducir un corte en la cola de ratones inyectados en el h’gado con cŽlulas iPS no sufr’an da–os importantes mientras que los ratones control no inyectados mor’an en pocas horas. Al a–o siguiente, en 2010, el mismo grupo lograba revertir la hiperglicemia en ratones diabŽticos de tipos 1 y 2 mediante la obtenci—n y transferencia de cŽlulas beta pancre‡ticas a partir de cŽlulas iPS (36).
En 2010, Yamanaka, Okano y colaboradores (37) obtuvieron neuroesferas ÒsegurasÓ (que no inducen tumorogŽnesis) derivadas de cŽlulas iPS que originaban in vitro neuronas, astrocitos y oligodendrocitos de rat—n electrofisiol—gicamente funcionales. Adem‡s, cuando dichas neuroesferas ÒsegurasÓ eran trasplantadas a la mŽdula espinal de un rat—n 9 d’as despuŽs de haberle producido el da–o, se diferenciaban en los tres linajes celulares neurales sin formar teratomas ni tumores, participando en la remielizaci—n e inducci—n del recrecimiento axonal de las fibras serotonŽrgicas, contribuyendo a la recuperaci—n de la funci—n locomotora.
Aplicaci—n terapŽutica en humanos
Estas investigaciones suponen un paso adelante esperanzador en la posible utilizaci—n de cŽlulas iPS en la terapia celular humana del futuro, obviando los problemas Žticos de la manipulaci—n de embriones.
La aplicaci—n terapŽutica de las cŽlulas iPS podr’a plantearse en tratamiento cl’nicos in vivo sobre los pacientes que necesitar‡n disponer de las garant’as suficientes que eviten efectos secundarios nocivos como puede ser la producci—n de tumores o en experimentos de laboratorio in vitro segœn el modelo de Òenfermedades en placa petriÓ que permitan conocer los procesos de la enfermedad o realizar pruebas toxicol—gicas para el desarrollo de nuevos f‡rmacos.
Efectivamente, en 2008, Eggan y colaboradores (38) lograron mediante la tŽcnica de inducci—n de cŽlulas iPS generar in vitro a partir de fibroblastos de piel cŽlulas nerviosas motoras en un paciente de 82 a–os que padec’a esclerosis lateral amiotr—fica (ELA), que son precisamente las cŽlulas da–adas por la enfermedad. La tŽcnica consisti— en introducir en los fibroblastos los genes Klf4, Sox2, Oct4 y c-Myc utilizando como vector un retrovirus. TambiŽn Park y colaboradores indujeron la obtenci—n de cŽlulas iPS en casos de distrofia muscular y de la enfermedad de Huntington (39).
Posteriormente, en 2009, Svendsen y colaboradores (40) obtuvieron cŽlulas iPS a partir de fibroblastos de piel de un ni–o afecto de atrofia muscular espinal (AME), enfermedad autos—mica recesiva que suele manifestarse a partir de los 6 meses de edad y que produce la muerte del paciente en torno a los dos a–os. Las cŽlulas iPS obtenidas generaban neuronas motoras defectuosas de manera que, como dicen los autores del trabajo, se pueden estudiar comparativamente con las cŽlulas nerviosas hom—logas producidas por la madre fenot’picamente sana del ni–o enfermo y poder as’ estudiar los mecanismos de la enfermedad. En la tŽcnica se utilizaron los genes Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 que fueron introducidos en los fibroblastos utilizando como vector un lentivirus.
Las cŽlulas iPS espec’ficas del s’ndrome de Rett muestran una disminuci—n en la densidad de espinas despuŽs de la diferenciaci—n neuronal (41).
La diferenciaci—n de hepatocitos a partir de cŽlulas iPS en pacientes con deficiencia para la α1-antitripsina produce una acumulaci—n elevada de l’pidos y glic—geno (42).
En 2011, Izpisœa y colaboradores (43) obtuvieron cŽulas iPS sanas a partir de fibroblastos de piel de ni–os que padec’an la enfermedad de Hunchinson-Gilford de envejecimiento prematuro (progeria) y que al ser rediferenciadas a cŽlulas musculares lisas volv’an a manifestar las caracter’sticas de la enfermedad (acumulaci—n de progerina y desorganizaci—n de la lamina nuclear). Sus investigaciones pueden permitir estudiar las causas del envejecimiento in vitro.
Recientemente, tambiŽn de han utilizado las cŽlulas iPS en enfermedades de manifestaci—n tard’a como la ataxia espinocerebelar (44), la enfermedad de Alzheimer (45), la enfermedad de Huntington (46) y la enfermedad de Parkinson: en 2012, Izpisœa y colaboradores (47) obtuvieron cŽlulas iPS a partir de cŽlulas de la piel de pacientes con la enfermedad de Parkinson comprobando que las cŽlulas iPS presentaban una anomal’a en la membrana nuclear semejante a la que presentaban las cŽlulas de una muestra post mortem del cerebro de pacientes que hab’an padecido dicha enfermedad. TambiŽn se han iniciado estudios con enfermedades complejas como la esquizofrenia (48).
A modo de resumen, en el Cuadro 1 se resumen las investigaciones m‡s importantes descritas anteriormente indicando los autores y las fechas correspondientes:
Cuadro 1.- CŽlulas troncales pluripotentes inducidas (iPS).
CŽlulas iPS en rat—n |
Yamanaka (2006, 2008); Jaenisch (2007, 2009); Schšler (2009); Blasco (2009); Ding (2009) |
CŽlulas iPS humanas |
Yamanaka (2007, 2011); Thomson (2007); Park (2008); Jaenisch (2008, 2009); Lowry (2008); Izpisœa Belmonte (2008); Melton (2008); Rossi (2010); Gage (2011) |
Aplicaciones terapŽuticas en rat—n como modelo experimental |
Anemia falciforme HbS (Jaenisch, 2007); hemofilia A (Ward y Ma, 2009); diabetes (Ward y Ma, 2010); lesiones en mŽdula espinal (Yamanaka y Okano, 2010) |
Aplicaciones terapŽuticas en humanos |
Esclerosis lateral amiotr—fica, ELA (Eggan, 2008); distrofia muscular y enfermedad de Huntington (Park, 2008 y The HD iPSC Consortium, 2012); atrofia muscular espinal, AME (Svendsen, 2009); s’ndrome de Rett (Marchetto, 2010); deficiencia en α1-antitripsina (Rashid, 2010); ataxia espinocerebelar (Koch, 2011); progeria (Izpisœa Belmonte, 2011); esquizofrenia (Brennand, 2011); enfermedad de Parkinson (Izpisœa Belmonte, 2012); enfermedad de Alzheimer (Israel, 2012) |
La importancia del descubrimiento de la posibilidad de obtener cŽlulas troncales pluripotentes inducidas (cŽlulas iPS) por reprogramaci—n celular de cŽlulas som‡ticas adultas mereci— ser seleccionado por la revista Science (49) como el segundo de los diez descubrimientos cient’ficos m‡s importantes del a–o 2007 y como el m‡s importante del a–o 2008. Consideraba la revista que la obtenci—n de cŽlulas iPS es el logro de Òuna haza–a largamente buscada de alquimia celularÓ: as’ como los antiguos alquimistas buscaban convertir metales vulgares en oro, los cient’ficos actuales han logrado convertir cŽlulas humanas diferenciadas en cŽlulas iPS, el equivalente biol—gico del oro.
Al igual que le ha sucedido al Dr. Ian Wilmut con la clonaci—n en relaci—n con el galard—n Nobel concedido al Dr. Gurdon que he comentado anteriormente, el Dr. James A. Thomson ha experimentado una situaci—n an‡loga por partida doble. En efecto, la historia de la cŽlulas troncales pluripotentes embrionarias empez— en 1981 cuando Sir Martin J.
Evans −galardonado con el Premio Nobel en Fisiolog’a o Medicina en 2007− logr— aislarlas y cultivarlas a partir de embriones de rat—n en fase de blastocisto (50). A–os m‡s tarde, en 1998, el grupo dirigido por James A. Thomson, de la Universidad de Wisconsin-Madison, consigui— aislar y mantener en cultivo cŽlulas troncales embrionarias a partir de blastocistos humanos (51), continuando de alguna manera lo que Evans hab’a logrado en ratones en 1981 y abriendo un nuevo campo cient’fico en la Medicina. Este a–o por segunda vez se ve privado el Dr. Thomson del galard—n Nobel a pesar de haber obtenido casi simult‡neamente con el Dr. Yamanaka las cŽlulas troncales pluripotentes inducidas humanas. Como es sabido, la normativa de la Instituci—n Nobel proh’be dar el mismo premio a m‡s de tres personas, de no tratarse de un colectivo u organizaci—n.
Los intentos de abrir las puertas a la clonaci—n humana con fines terapŽuticos (obtenci—n de embriones som‡ticos por transferencia nuclear de cŽlulas del propio paciente) puede que resulten innecesarios si llega a hacerse una realidad cl’nica la reprogramaci—n de cŽlulas som‡ticas adultas utilizando las tŽcnicas de Yamanaka, Thomson y Jaenisch antes descritas. En este contexto cabe se–alar que el Dr. Ian Wilmut, padre cient’fico de la oveja Dolly, anunci— que abandonaba la investigaci—n en clonaci—n terapŽutica humana para pasarse a la utilizaci—n de la tŽcnica de reprogramaci—n celular de Yamanaka. TambiŽn JosŽ B. Cibelli, uno de los pioneros de la clonaci—n humana (52), se ha manifestado a favor de la nueva tŽcnica de reprogramaci—n mientras que otros cient’ficos siguen aferr‡ndose a la investigaci—n con cŽlulas troncales embrionarias como a un clavo ardiendo.
Los defensores de continuar investigando con cŽlulas troncales embrionarias humanas defienden su posici—n, argumentando que si no hubiera sido por estas investigaciones no se hubiera llegado a conocer el papel de los factores de transcripci—n Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog y Lin28 en el proceso de reprogramaci—n celular de cŽlulas som‡ticas adultas.
En el presente contexto, es importante se–alar que, segœn datos de los NIH de los Estados Unidos (53), en diciembre de 2012 se hab’an registrado en todo el mundo 4118 investigaciones cl’nicas con cŽlulas troncales adultas (AS), 24 con cŽlulas troncales embrionarias (ES) y 19 con cŽlulas troncales pluripotentes inducidas (iPS) (14 en Estados Unidos, 3 en Israel, 1 en Francia y 1 en Ir‡n). Desde el punto de vista Žtico resulta interesante resaltar que la comunidad cient’fica parece dispuesta a evitar la utilizaci—n de cŽlulas troncales de embriones humanos (0,6%); incluso, en Estados Unidos hay 14 investigaciones cl’nicas con cŽlulas iPS frente a 8 con cŽlulas ES.
6. REPROGRAMACIîN DIRECTA
En la dŽcada de los sesenta del siglo pasado, Ernst Hadorn (54) introdujo los conceptos de determinaci—n y transdeterminaci—n en sus estudios de genŽtica del desarrollo en Drosophila. Segœn Hadorn, la diferenciaci—n celular se inicia por el proceso de la determinaci—n que programa la cŽlula para su futuro comportamiento en el desarrollo.
En unos casos, la diferenciaci—n celular es inmediata a su determinaci—n mientras que en otros casos la determinaci—n supone un estado celular reproducible propagado durante una fase indiferenciada m‡s o menos larga hasta que en un momento dado esas cŽlulas determinadas se diferencian. Se entiende por herencia celular a la propiedad individual de las cŽlulas de mantener y transmitir su estado de determinaci—n. Utilizando en su investigaci—n discos imaginales de Drosophila (primordios celulares presentes en las larvas que durante la metamorfosis se transforman en estructuras espec’ficas de la mosca adulta), Hadorn observ— que ocasionalmente se pod’an producir cambios en la herencia celular, de manera que discos imaginales de una cierta estructura adulta (alas, patas, antenas, ojos, etc.) dan lugar a otra estructura. Al fen—meno que produce tales cambios en la herencia celular se le denomina transdeterminaci—n.
La Instituci—n Nobel (55) recordaba estos datos cient’ficos de hace casi medio siglo por analog’a con los procesos de reprogramaci—n directa o transdiferenciaci—n que en la actualidad est‡n llev‡ndose a cabo utilizando tŽcnicas semejantes a las establecidas por Yamanaka.
Efectivamente, un nuevo paso conceptualmente diferente a la tŽcnica de inducci—n de cŽlulas troncales pluripotentes (iPS) de Yamanaka lo dio en 2008 el grupo de Douglas A. Melton (56) al reprogramar in vivo cŽlulas adultas de rat—n (cŽlulas exocrinas del p‡ncreas) transform‡ndolas directamente (reprogramaci—n directa o transdiferenciaci—n) en cŽlulas beta pancre‡ticas capaces de producir insulina (islotes de Langerhans). Las cŽlulas obtenidas son indistinguibles de las cŽlulas beta pancre‡ticas end—genas, tanto en tama–o como en su forma y estructura. Para ello, utilizaron como vector un adenovirus en el que se hab’an incorporado tres factores de transcripci—n (Ngn3, Pdx1 y MafA) que el grupo de Melton hab’a identificado previamente como responsables de la diferenciaci—n de las cŽlulas beta pancre‡ticas. El experimento realizado con ratones in vivo mostr— que las cŽlulas beta obtenidas mejoraban sensiblemente la condici—n de hiperglicemia de los ratones diabŽticos. No cabe duda que estos resultados son esperanzadores para tratar de curar en el futuro la enfermedad de la diabetes tipo 1 en humanos.
M‡s tarde, en 2010 y 2011, Wernig y colaboradores (57), partiendo de la hip—tesis de que la expresi—n combinatoria de factores de transcripci—n espec’ficos del linaje neural podr’a convertir directamente fibroblastos en neuronas, utilizaron un conjunto de 19 genes candidatos de los que solamente tres factores (Ascl3, Brn2 tambiŽn denominado Pou3f2 y Myt1l) eran suficientes para convertir con rapidez y eficacia fibroblastos embrionarios y postnatales de rat—n directamente en neuronas funcionales in vitro. Las cŽlulas neuronales inducidas (iN) expresan mœltiples prote’nas espec’ficas de neurona, generan potenciales de acci—n y forman sinapsis funcionales. Los autores se–alaban que la generaci—n de cŽlulas iN a partir de linajes no neurales podr’a tener importantes implicaciones tanto en el estudio del desarrollo neural como en el dise–o de modelos de enfermedades neurol—gicas y la Medicina regenerativa.
Bhatia y colaboradores (58) lograron la conversi—n directa de fibroblastos humanos en cŽlulas progenitoras hematopoyŽticas que daban lugar a linajes granuloc’ticos, monoc’ticos, megacarioc’ticos y eritroides. TambiŽn en 2010, Ieda y colaboradores (59) transformaron in vitro fibroblastos en cardiomiocitos utilizando tres factores de transcripci—n y en 2012 dos grupos de investigaci—n distintos (60,61) induc’an in vivo la transformaci—n directa de fibroblastos en cardiomiocitos de rat—n utilizando los mismos tres factores de transcripci—n. Es importante resaltar que estas investigaciones muestran la posibilidad de lograr la transdiferenciaci—n o reprogramaci—n directa no s—lo entre cŽlulas dentro de una misma capa germinal, sino tambiŽn entre cŽlulas de capas germinales diferentes como es el caso de fibroblastos (mesodermo) a neuronas (ectodermo).
La nueva tŽcnica de reprogramaci—n directa se salta el paso intermedio de las cŽlulas iPS por el que la cŽlula tratada se revierte al estado de maduraci—n de una cŽlula para que sea pluripotente. Es evidente que se ha abierto un nuevo y esperanzador campo para la medicina regenerativa del futuro. Adem‡s, como en el caso de la utilizaci—n de las cŽlulas troncales adultas (AS) y las cŽlulas troncales pluripotentes inducidas (iPS), se obvian los problemas Žticos que plantea la utilizaci—n de las cŽlulas troncales pluripotentes embrionarias (ES).
7. EPIGƒNESIS
En el presente contexto, me parece interesante hacer un breve comentario sobre la epigŽnesis, teniendo en cuenta que su significado ha tenido algunas variaciones a lo largo del tiempo. La GenŽtica del Desarrollo estudia los procesos genŽticos que controlan el paso de cigoto a adulto. Las concepciones cl‡sicas de preformaci—n (Hartsoecker, 1695) y epigŽnesis (Wolff, 1759) encuentran una base genŽtica en su sentido conceptual por cuanto, por un lado, el cigoto reœne ya en forma de ADN lo que ha de ser el nuevo individuo (preformaci—n) y, por otro lado, esa informaci—n genŽtica controla espacial y temporalmente los procesos que constituyen las sucesivas etapas del desarrollo como liberaci—n de las potencialidades contenidas en la cŽlula inicial œnica (epigŽnesis) (62).
En Embriolog’a, por ÒepigŽnesisÓ – en contraposici—n a la Òpreformaci—nÓ– se entiende la teor’a de que las estructuras nuevas y los organismos se desarrollan a partir de una masa indiferenciada original de materia viva en el curso del desarrollo embrionario. Waddington (63) defini— ya en los a–os 1939 y 1940 la ÒepigenŽticaÓ como la rama de la Biolog’a que se ocupa del an‡lisis causal del desarrollo, definiendo a su vez el ÒepigenotipoÓ como el sistema de desarrollo total que est‡ compuesto por series de desarrollo interrelacionadas a travŽs de las cuales se realiza la forma adulta de un organismo y que comprende la totalidad de las interacciones entre los genes y entre los genes y el ambiente no genŽtico que da como resultado el fenotipo (ÒepifenotipoÓ). El epigenotipo de una cŽlula es un car‡cter estable y heredable, al menos durante muchas generaciones celulares, cuyo modo de impresi—n est‡ por encima o adem‡s del genotipo cl‡sico, esto es, la secuencia de bases del ADN (64).
En tiempos recientes ha surgido dentro de la GenŽtica un nuevo concepto de ÒepigenŽticaÓ(65) en relaci—n con los mecanismos genŽticos que influyen en el fenotipo sin alterar las secuencias del ADN, siendo la metilaci—n del ADN (generalmente de las citosinas) uno de los mecanismos epigenŽticos m‡s importantes (patr—n de metilaci—n del ADN o metiloma).
Mecanismos epigenŽticos son tambiŽn las alteraciones de la estructura o remodelaci—n de la cromatina por modificaci—n de las histonas (metilaci—n, acetilaci—n, fosforilaci—n) (66). La estructura local de la cromatina es un estado epigenŽtico que puede cambiar de forma reversible por diversos tipos de mecanismos (remodelaci—n de la cromatina). El hecho de que la actividad gŽnica diferencial –a la que hac’amos referencia al definir el concepto genŽtico de desarrollo– no implique cambios en la secuencia original del ADN explica por quŽ son posibles los mecanismos de reprogramaci—n celular tales como la clonaci—n por transferencia nuclear y la inducci—n de cŽlulas troncales pluripotentes que han sido objeto del Premio Nobel en Fisiolog’a o Medicina 2012.
En mi opini—n, la confusi—n que en ocasiones se produce en el debate actual sobre lo que se denomina el Òestatuto del embri—n humanoÓ es que se argumenta que el simple programa genŽtico que contiene el cigoto producido por la fecundaci—n de los gametos es necesario pero no suficiente para que se realice el proceso de desarrollo ya que son necesarios tambiŽn los fen—menos epigenŽticos como, por ejemplo, el silenciamiento de la expresi—n de los genes por la metilaci—n de su ADN, pero manteniendo la secuencia original del ADN que constituye el programa genŽtico del organismo reunido en el cigoto tras el proceso de fecundaci—n de los gametos.
8. EPêLOGO
Una vez m‡s, puedo terminar mi intervenci—n en la Sesi—n Cient’fica que la Real Academia Nacional de Farmacia dedica a glosar los Premios Nobel concedidos en el a–o mostrando mi orgullo de pertenecer a un ‡mbito del conocimiento cient’fico como es la GenŽtica merecedora del m‡s alto reconocimiento como son los premios Nobel.
As’ pues, repitiendo y actualizando lo que he venido diciendo en otras ocasiones, hoy, en 2012, podemos estar orgullosos los amantes de la GenŽtica porque ya son 40 las veces en que el galard—n Nobel ha correspondido a 89 cient’ficos del campo de la GenŽtica o ciencias afines.
De los 40 premios considerados, 31 pertenecen al ‡mbito de la Fisiolog’a o Medicina, 8 a la Qu’mica y 1 de la Paz y, a su vez, de los 89 cient’ficos galardonados, 70 corresponden a premios de Fisiolog’a o Medicina, 18 de Qu’mica y 1 de la Paz.
Finalmente, me gustar’a destacar que en los doce a–os transcurridos del siglo XXI se ha premiado la investigaci—n genŽtica en doce ocasiones: 2001, 2002, 2004, dos en 2006, 2007, dos en 2008, dos en 2009, 2011 y en 2012. Sin duda, es una dŽcada prodigiosa para la GenŽtica como una Alicia en el ÒPa’s de las maravillas molecularesÓ que dir’a Lewis Carroll. En 1995 iniciŽ con mi discurso de ingreso en esta Real Academia (67) la historia ÒnobeladaÓ de la GenŽtica que tuve la oportunidad de actualizar doce a–os despuŽs (68), en 2007, y que he puesto al d’a en 2012. No obstante, al paso que vamos, es posible que pronto se vuelva a quedar viejo.
Perm’taseme finalizar esta intervenci—n pregunt‡ndome en voz alta Àpara cu‡ndo espera la Instituci—n Nobel premiar la investigaci—n gen—mica? En mi opini—n, de los grandes temas actuales de investigaci—n dentro de la GenŽtica, la Gen—mica es el œnico que falta por recibir el galard—n Nobel. En ocasiones anteriores me he atrevido a citar a cient’ficos como Craig J. Venter y Francis Collins como merecedores del premio Nobel. Me pregunto si la controvertida personalidad del primero puede ser la causa de que se estŽ retrasando la decisi—n porque es evidente que no se puede premiar este campo de la investigaci—n genŽtica dejando fuera al Dr. Venter. El tema es de urgente soluci—n porque, como dec’an Lander y Weinberg en un art’culo publicado en la revista ÒScienceÓ (68), la Gen—mica ocupa hoy d’a el centro de la Biolog’a (ÒGen—mica: viaje al centro de la Biolog’aÓ, parafraseando el t’tulo de la conocida novela de Julio Verne). En la misma l’nea apuntan las palabras de Victor McKusick (69), uno de los grandes cient’ficos en el campo de la GenŽtica Humana, cuando dec’a:
Òlos laboratorios gen—micos ser‡n el lugar de formaci—n de los cient’ficos del futuro: nueva raza de cient’ficos preparados para capitalizar tanto la revoluci—n de la GenŽtica Molecular como la revoluci—n de la computaci—n. Ellos ser‡n los l’deres de la Biolog’a del siglo XXIÓ.
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