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Control hipotal‡mico de las interacciones neuroendocrinas

Blanca Lizarbe y Sebasti‡n Cerd‡n*

Instituto de Investigaciones BiomŽdicas ÒAlberto SolsÓ CSIC/UAM, c/ Arturo Duperier 4. 28029

Madrid (Espa–a).

e-mail: scerdan@iib.uam.es

Recibido el 27 de marzo de 2013                               An. Real Acad. Farm. Vol 79, N¼ 1 (2013), pag. 90-110 FISIOLOGIA Y CONTROL CEREBRAL DEL COMPORTAMIENTO. Mesa Redonda celebrada en la Real Academia Nacional de Farmacia el d’a 29 de noviembre del 2012. Coordinadora: A. M. Pascual-Leone AcadŽmica de Nœmero de la RANF.

RESUMEN

El hipot‡lamo juega en los mam’feros superiores un papel central en la integraci—n de funciones vitales como la regulaci—n del metabolismo energŽtico global, la saciedad y el hambre, el control de la presi—n sangu’nea y la temperatura corporal, la sed, hidrataci—n y metabolismo salino del organismo, y las funciones testiculares y ov‡ricas, entre otras. Muchas de estas funciones neuroendocrinas se realizan mediante el control del funcionamiento de la hip—fisis, utilizando un complejo sistema de retroalimentaci—n que modula la secreci—n de una gran variedad de hormonas hipofisarias con efectos sistŽmicos de vital importancia, incluyendo las hormonas tiroideas o la hormona del crecimiento, entre otras. El hipot‡lamo consta de aproximadamente una docena de subestructuras, conocidas como nœcleos hipotal‡micos, que se encargan de controlar los diversos procesos. Hasta muy recientemente no ha sido posible evaluar la funci—n hipotal‡mica directamente in vivo, un aspecto que se resolv’a mediante procedimientos indirectos como la determinaci—n de cambios en el peso corporal, eliminaci—n de l’quidos, alteraciones en la termorregulaci—n o desequilibrios en el perfil de hormonas en sangre. En esta revisi—n describiremos toda una nueva serie de mŽtodos de imagen no invasiva para la evaluaci—n directa de la funci—n hipotal‡mica y su impacto potencial en nuestro conocimiento actual de la regulaci—n de las interacciones neuroendocrinas, con especial referencia a la regulaci—n hipotal‡mica del apetito in vivo.

Palabras clave: Hipot‡lamo; Nœcleos hipotal‡micos; Control del apetito; Imagen por Resonancia MagnŽtica; Espectroscop’a por Resonancia MagnŽtica.

ABSTRACT

Control of hypothalamic neuroendocrine interactions

The hypothalamus plays in higher mammals a central role in the integration of vital functions as the regulation of global energy metabolism, satiety and hunger, the control of blood pressure and body temperature, thirst, hydration and electrolyte metabolism, testicular and or ovarian functions, among others. Many of these neuroendocrine functions are performed through the control of the performance of the hypophysis, using a complex system of feed- back loops that modulate the secretion of large variety of hypophysary hormones with systemic effects of vital importance, including the thyroid and growth hormones, among others. The hypothalamus has approximately a dozen of substructures, known as hypothalamic nuclei, which control the different processes. Until very recently, it has not been possible to evaluate directly the hypothalamic function in vivo, an aspect solved through indirect measurements as the determination of bodyweight changes, liquid elimination and alterations in thermoregulation or disequilibria in the hormonal profiles in blood. In this review we shall describe a novel series of non-invasive imaging and spectroscopy methods for the direct evaluation of hypothalamic function and their potential impact on our current knowledge of neuroendocrine regulation, with special reference to the hypothalamic regulation of appetite in vivo.

Keywords: Hypothalamus; Hypothalamic nuclei; Appetite control; Magnetic Resonance Imaging; Magnetic Resonance Spectroscopy.

1. Introducci—n

El hipot‡lamo es una peque–a estructura cerebral responsable del equilibrio homeost‡tico de funciones sistŽmicas vitales como el metabolismo energŽtico global, el apetito, la sed y la regulaci—n osm—tica, la termorregulaci—n, los ritmos circadianos y algunas respuestas fundamentales para la supervivencia como la agresividad (1,2). La evaluaci—n de su actividad fisiol—gica in vivo se ha realizado, hasta muy recientemente, empleando mŽtodos indirectos como las medidas de peso corporal e ingesta de alimentos, o abordajes invasivos, midiendo concentraciones de hormonas en sangre o mediante la implantaci—n de microelectrodos (3,4).

Los procedimientos no invasivos de evaluaci—n de la funci—n hipotal‡mica, han permanecido limitados hasta muy recientemente, por las dificultades impuestas en la adquisici—n de im‡genes por las reducidas dimensiones del hipot‡lamo y por la complejidad de los procesos retroalimentaci—n que subyacen a la funci—n hipotal‡mica.

Las nuevas tecnolog’as de Resonancia MagnŽtica proporcionan herramientas robustas que permiten superar estas limitaciones, habiendo proporcionado en la œltima dŽcada, resultados funcionales importantes sobre la fisiolog’a hipotal‡mica in vivo (5,6).

En este contexto, resulta apropiado revisar el progreso adquirido hasta ahora y evaluar cr’ticamente las ventajas e inconvenientes de cada abordaje.

El presente trabajo revisar‡ la informaci—n generada mediante la aplicaci—n al hipot‡lamo de tŽcnicas de imagen y espectroscop’a por Resonancia MagnŽtica, proporcionando algunas recomendaciones para futuras aplicaciones.

Dada la diversidad de las funciones hipotal‡micas, este trabajo se centrar‡ principalmente en la regulaci—n del apetito y metabolismo energŽtico global, una de las funciones hipotal‡micas con mayor repercusi—n fisiopatol—gica y socioecon—mica.

Comenzaremos con una breve descripci—n de los mecanismos fisiol—gicos de control del apetito, para describir despuŽs las tecnolog’as MRI utilizadas en su evaluaci—n, incluyendo BOLD (Blood Oxygenation Level Dependent contrast; Contraste basado en la oxigenaci—n de la sangre), MEMRI (Manganese Enhanced Magnetic Resonance Imaging; Resonancia MagnŽtica potenciada en captaci—n de Mn2+) y DWI (Diffusion Weighted Magnetic Resonance Imaging; Resonancia magnŽtica potenciada en difusi—n).

Terminaremos con una revisi—n cr’tica de las contribuciones de la espectroscop’a por Resonancia MagnŽtica, tanto in vivo como en el Ò‡ngulo m‡gicoÓ (HRMAS; High Resolution Magic Angle Spinning) y una propuesta de actividades futuras.

2. Control hipotal‡mico del apetito

Nuestro conocimiento sobre los mecanismos hipotal‡micos que regulan el apetito y la homeostasis energŽtica ha progresado considerablemente en los œltimos a–os (7). El control del apetito se entiende, en el contexto actual, como el resultado de un complejo balance entre se–ales perifŽricas e intrahipotal‡micas que controlan, a corto plazo, la sensaci—n de hambre o saciedad, y a largo plazo, la regulaci—n del peso corporal y balance energŽtico (8).

Estos procesos parecen incluir adem‡s, la participaci—n de otras estructuras cerebrales, corticales, l’mbicas y del tronco cerebral. Las principales se–ales perifŽricas son la leptina, una hormona producida en el tejido adiposo, y la insulina, una hormona proveniente del p‡ncreas. Adem‡s, participan como se–ales del estado energŽtico perifŽrico, pŽptidos que provienen del est—mago, como el pŽptido YY (PYY), la oxintomodulina (OXM), la grelina, el pŽptido an‡logo de glucag—n 1 (GLP-1) y la colecistokininina (CKK). Estas se–ales pasan con facilidad la fr‡gil barrera hematoencef‡lica del hipot‡lamo y, una vez all’, modulan la actividad catab—lica (+) o anab—lica (-) de los nœcleos Arcuado (ARC), Ventromedial (VMN), Dorsomedial (DMN) y Paraventricular (PVN) (Figura 1). Estos controlan la ingesta de comida mediante procesos altamente evolucionados de Òfeed-backÓ o retroalimentaci—n entre se–ales orexigŽnicas (de estimulaci—n de apetito) y anorexigŽnicas (de saciedad) (9).

Figura 1.- Control hipotal‡mico del balance energŽtico global. El apetito est‡ regulado por un balance complejo que involucra se–ales endocrinas originadas en los tejidos perifŽricos y pŽptidos intrahipotal‡micos. La leptina y la insulina inhiben las neuronas orexigŽnicas NPY/AgRP (morado) y estimulan las neuronas anorexigŽnicas de melacnocortina (verde), produciendo una disminuci—n del apetito. La grelina o el pŽtido PYY3-36 inhiben las NPY/AgPR resultando en respuestas orexigŽnicas o anorexigŽnicas, respectivamente. Imagen obtenida de (10) y reproducida con permiso de la revista.

La Figura 1 resume estos procesos incluyendo, las hormonas leptina e insulina , que pueden tener distinto efecto dependiendo de su concentraci—n en sangre, las se–ales perifŽricas con efectos orexigŽnicos (grelina) o anorexigŽnicos (PYY) (10) y los componentes de se–alizaci—n intrahipotal‡micos. Las cantidades de leptina e insulina circulan en sangre en funci—n de la cantidad de grasa corporal y de los niveles de glucosa, respectivamente, llegando al hipot‡lamo a travŽs del nœcleo ARC, donde la barrera hematoencef‡lica (BBB) resulta altamente permeable. La llegada en exceso de estas se–ales inhibe la activaci—n de las neuronas orexigŽnicas del Neuropeptido Y (NPY) y Agouti Related Peptide (AgRP) (color morado) y activa las neuronas anorexigŽnicas de melacortina (α-MSH) y del transcrito regulado por anfetamina (Cocaine-Anphetamine-Regulated Transcript; CART ) (en verde). Este balance tiene como consecuencia una disminuci—n de la ingesta de comida (saciedad) y un incremento del gasto energŽtico. Los niveles bajos de leptina e insulina en sangre promueven, en cambio, la activaci—n de las neuronas orexigŽnicas y la inhibici—n de las anorexigŽnicas, produciendo un aumento de la sensaci—n de hambre y un ahorro en el gasto energŽtico.

La acci—n de la grelina y el pŽptido PYY3-36, segregados en el est—mago y en el colon, respectivamente, proporcionan al nœcleo ARC se–ales positivas (grelina) y negativas (PYY) que a corto plazo promueven sensaciones de hambre y saciedad, respectivamente, mediante la activaci—n o inhibici—n selectiva de los grupos neuronales espec’ficos del hipot‡lamo (11). A m‡s largo plazo, los niveles altos de leptina e insulina en sangre pueden producir una desensibilizaci—n de sus receptores, originando fen—menos de resistencia a la insulina y/o leptina, aumentando los niveles de glucosa en plasma y la acumulaci—n de l’pidos, que pueden causar eventualmente diabetes y obesidad.

3. Estudios de MRI de la Regulaci—n Hipotal‡mica del Apetito

Las tŽcnicas de imagen m‡s utilizadas en estudios de regulaci—n del apetito in vivo son: BOLD, MEMRI y DWI. BOLD infiere la actividad neuronal en las regiones cerebrales activadas por los niveles de deoxihemoglobina paramagnŽtica y los cambios en perfusi—n sangu’nea (12,13). MEMRI utiliza la acumulaci—n de Mn2+ paramagnŽtico durante la activaci—n neuronal, un fen—meno que refleja competitivamente la acumulaci—n de Ca2+ durante los potenciales de acci—n (14). DWI detecta la activaci—n neuronal por los cambios en los par‡metros de difusi—n del agua, consecuencia de los flujos transcelulares de iones que ocurren durante la neurotransmisi—n (15), aunque tambiŽn se han atribuido los cambios a la aparici—n de procesos inflamatorios relacionados con la obesidad (16,17).

A continuaci—n, se proporciona una descripci—n detallada de la informaci—n conseguida con cada una de estas metodolog’as.

BOLD

BOLD es una de las tŽcnicas m‡s utilizadas para estudiar la actividad funcional del cerebro, tanto animales como en seres humanos. Se emple— para de detectar, a finales de los a–os noventa, la respuesta del hipot‡lamo a administraciones de glucosa (18,19). En ambos estudios, uno con seres humanos y el otro con ratas, se administr— glucosa a sujetos ayunados y se detect— una disminuci—n significativa de la se–al de resonancia en hipot‡lamo tras su administraci—n. En el estudio con humanos, se compar— la atenuaci—n de la se–al entre personas obesas y personas no obesas, resultando la inhibici—n de las primeras mucho menor y demostrando in vivo por primera vez la existencia de una funcionalidad alterada en el hipot‡lamo de sujetos obesos.

Unos a–os m‡s tarde, se estableci— la primera correlaci—n de BOLD, como contraste de los centros de regulaci—n del apetito en animales, con un marcador de activaci—n neuronal muy establecido, c-Fos (20). Esta correlaci—n se verific— un tiempo despuŽs (21), en un estudio en el que se compar— el efecto de la administraci—n de 2-deoxy-D- glucosa en los nœcleos hipotal‡micos con mapas de actividad de c-Fos en los mismos. Desde entonces, el uso de la tŽcnica BOLD para el estudio de la regulaci—n del apetito en animales ha generado un nœmero importante de contribuciones, sobre todo relacionadas con los efectos de activaci—n hipotal‡mica tras la administraci—n de diferentes dietas o pŽptidos (22,23).

En los estudios con seres humanos, se ha dedicado un esfuerzo considerable a estudiar la contribuci—n de otras zonas cerebrales extrahipotal‡micas a la regulaci—n integral del apetito, utilizando estimulaciones del apetito mediante activaciones visuales (fotograf’as de comida) (24), o respuestas espec’ficas a distintos sabores (25).

La Figura 2, ilustra una aplicaci—n representativa de la imagen BOLD aplicada a un estudio de regulaci—n del apetito. Este estudio monitoriz— la actividad cerebral de voluntarios humanos tras visualizar fotograf’as de alimentos cal—ricos y no cal—ricos y de utensilios relacionados con la comida, pero no comestibles. Se encontraron ‡reas de activaci—n comunes a los est’mulos de comida, independientemente de su contenido cal—rico, como la am’gdala o el hipocampo. Solamente las fotograf’as de alimentos de alto valor cal—rico activaron las zonas del hipot‡lamo, entre otras regiones.

Figura 2.- Mapas paramŽtricos estad’sticos (SPM) de las regiones activadas en el cerebro humano, medidos con BOLD, durante la visualizaci—n de im‡genes de alto contenido cal—rico. La barra de color refleja la escala de la estad’stica SPM utilizada para el an‡lisis. La corteza prefrontal y dorsolateral, el t‡lamo y el hipot‡lamo muestran activaci—n significativa (p<0.005) relativamente a la activaci—n detectada tras mostrar fotograf’as de utensilios no comestibles. Reproducido de (29) con permiso del editor.

 

Estos estudios, demostraron que el apetito en seres humanos es el resultado de un complejo entramado de redes neuronales que incluye, adem‡s del hipot‡lamo y del tronco encef‡lico, regiones corticol’mbicas y corticales. Esta mœltiple regulaci—n est‡ relacionada aparentemente con los efectos cerebrales de recompensa a la ingesta de comida, con los est’mulos del apetito presentes en el ambiente, y con otros factores cognitivos o incluso emocionales (26).

En este contexto, se han investigado con Žxito las respuestas funcionales a se–ales orexigŽnicas y anorexigŽnicas en el cerebro humano. Estudios BOLD de administraci—n del pŽptido PYY a voluntarios humanos sanos (27) con niveles altos de PYY en plasma indicaron que, como sucede en los estados alimentados, la activaci—n cerebral de la corteza orbitofrontal caudolateral (OFC) predice la ingesta de comida. Por lo contrario, niveles bajos de PYY en plasma, como sucede en condiciones de ayuno, es la actividad hipotal‡mica la est‡ correlacionada con la ingesta de comida. As’ se pudo demostrar por primera vez que la presencia de una se–al de saciedad post-ingesta cambia las zonas de activaci—n cerebral.

Casi al mismo tiempo, en estudios de administraci—n de grelina, una se–al orexigŽnica (28) se pudo demostrar que la respuesta neuronal a est’mulos visuales relacionados con el apetito era superior tambiŽn en la zona OFC, y en otras regiones implicadas en la codificaci—n de incentivos del apetito. En definitiva este trabajo demostr—, que la presencia de se–ales metab—licas como la grelina pod’a favorecer el consumo de alimentos mediante la activaci—n de zonas del sistema hed—nico.

M‡s recientemente, las aplicaciones de BOLD en estudios de regulaci—n del apetito cubren principalmente tres ‡mbitos: la respuesta hipotal‡mica a la glucosa en condiciones normales o patol—gicas (29,30), las diferencias en control cerebral de apetito en personas obesas (31), y los efectos de las hormonas y pŽptidos en la regulaci—n del apetito(32-34).

MEMRI

La imagen MEMRI refleja de una forma directa y no invasiva la acumulaci—n de Mn2+ en las neuronas activadas, a travŽs de los canales de calcio dependientes del voltaje. Esta se extiende trans-sin‡pticamente, y permite la creaci—n de mapas de conectividad neural por contraste de Mn2+ (35). Muy posiblemente, la acumulaci—n de Mn2+ excede los tractos neuronales y se extiende hasta los astrocitos y redes de astrocitos circundantes, a travŽs de las numerosas gap- junctions que existen entre los mismos (36). En particular, ha sido posible demostrar que la activaci—n neuronal va acompa–ada de ondas intracelulares y extracelulares de Ca2+ (37,38). Los iones de Mn2+ presentan un radio i—nico es muy similar al del Ca2+, por lo que pueden mimetizar muy adecuadamente y de manera competitiva las acumulaciones de Ca2+ durante la activaci—n neuronal.

Sin embargo, en contraste con los iones Ca2+ que son diamagnŽticos, los iones Mn2+ son paramagnŽticos, por lo que inducen una reducci—n muy importante del tiempo de relajaci—n T1 del agua, que resulta f‡cilmente detectable en im‡genes de resonancia pesadas en T1. As’, las ‡reas de activaci—n y acumulaci—n de Mn2+ aparecen claramente m‡s brillantes que las que no lo acumulan, en lo que se conoce como efecto MEMRI (Manganese Enhanced Magnetic Resonance Imaging) (39).

La tŽcnica MEMRI presenta, sin embargo, una limitaci—n importante, debido a que el Mn2+ presenta notables efectos neurot—xicos. Esto se debe a su competici—n con los flujos intracelulares de Ca2+, una circunstancia que termina por alterar procesos metab—licos vitales como el ciclo tricarbox’lico, los intercambios neurogliales de los neurotransmisores glutamato o GABA y los niveles fisiol—gicos de metabolitos hipotal‡micos (40-42). Por ello, MEMRI s—lo puede ser utilizada hasta ahora en animales de experimentaci—n.

A pesar de sus limitaciones, MEMRI se ha utilizado con Žxito para detectar actividad cerebral en ratones, y su arquitectura y conectividad neuronal, desde el comienzo de los a–os dos mil (43,44). Las primeras aplicaciones de MEMRI al estudio de la activaci—n hipotal‡mica relacionada con el control apetito, aparecieron en 2006 (45,46).

En su trabajo, Kuo et al. compararon la activaci—n detectada en hipot‡lamo de ratones alimentados o ayunados, encontrando regiones espec’ficas de activaci—n, y siendo los primeros en conseguir la entrada directa de Mn2+ sangu’neo al hipot‡lamo, sin necesitar de la rotura previa de la barrera hematoencef‡lica.

Por su parte, Chaudri et al. encontraron diferentes patrones de activaci—n en el hipot‡lamo de ratones tras administrar oxintomodulina (OXM) y GLP-1, ambas hormonas anorexigŽnicas y generadas en el est—mago. La administraci—n de OXM produjo en una disminuci—n del contraste en la imagen, indicando una disminuci—n de la actividad neuronal, en los nœcleos ARC, PVN y supra—ptico del hipot‡lamo. GLP-1 caus—, sin embargo, una disminuci—n del contraste solamente en el PVN, y un incremento del mismo en el nœcleo VMN. Este estudio mostr— por primera vez c—mo dos pŽptidos aparentemente similares pod’an tener distintos patrones de activaci—n hipotal‡mica. Desde entonces, varios grupos han focalizado su trabajo a la aplicaci—n de MEMRI para el estudio de la funcionalidad hipotal‡mica en la regulaci—n del apetito; con estudios de administraci—n de pŽptidos (47-49), activaci—n cerebral en ratones transgŽnicos (50) y respuesta hipotal‡mica a alteraciones de ingesta de comida (51,52). Adem‡s, durante los œltimos a–os, el creciente interŽs en las aplicaciones de MEMRI y su posible interacci—n con diversos procesos hipotal‡micos, ha generado la aparici—n de un nœmero elevado de trabajos que combinan MEMRI con otras tŽcnicas, sobre todo espectrosc—picas con objeto de validar con MEMRI los diversos abordajes (50,53,40,54).

La Figura 3 muestra un ejemplo representativo de la utilizaci—n de MEMRI en el hipot‡lamo. Se trata de la comparaci—n de la actividad neuronal de los nœcleos hipotal‡micos en ratones normales y ratones genŽticamente obesos (ob/ob), en condiciones de alimentaci—n ad libitum. En este estudio, se infundi— Mn2+ en la vena de la cola de ratones control y de ratones obesos, deficientes en leptina, y se analiz— la intensidad de se–al resultante en los nœcleos VMN (o VMH) y ARC, y la zona del cuarto ventr’culo (V4). El contraste de manganeso comporta un mayor incremento de se–al espec’fico en los ratones obesos (en negro) que en los controles (en gris), en los nœcleos ARC y VMN; algo que no sucede en el V4. Esta circunstancia revela una mayor estimulaci—n orexigŽnica de los animales obesos, selectiva en ARC y VMN, en las mismas condiciones de alimentaci—n que los controles.

Figura 3.- Respuesta MEMRI en ratones obesos y ratones control. Inserto superior izquierdo: Localizaci—n del hipot‡lamo, tercer y cuarto ventr’culo en un atlas anat—mico [81]. Superior derecha: Incremento de se–al inducido por el contraste de Mn2+ (MEMRI) en el nœcleo ARC, VMN y en el cuarto ventr’culo (v4). Paneles inferiores: cinŽtica del incremento MEMRI en ARC, VMN y V4. Los ratones obesos (c’rculos negros) presentan mayor se–al con los controles (c’rculos grises) en los nœcleos hipotal‡micos, pero no el ventr’culo, revelando un efecto espec’fico en estos. Reproducida de (50) con el permiso de la revista.

DWI

La interpretaci—n de los modelos biof’sicos que subyacen a los cambios en la difusi—n browniana del agua en estados fisiol—gicos y patol—gicos, ha representado un motivo de discusi—n frecuente en las œltimas dŽcadas.

La difusi—n de las molŽculas de agua es un proceso aleatorio, y en medios homogŽneos, el decaimiento de la se–al de resonancia magnŽtica se puede describir por una funci—n monoexponencial caracterizada por un coeficiente de difusi—n D.

En la se–al observada con DWI, sin embargo, lo que se obtiene es resultado de la integraci—n de los desplazamientos microsc—picos de todas las molŽculas de agua presentes en un v—xel, por lo que D, se define mejor mediante un par‡metro de difusi—n aparente (ADC) (55).

En relaci—n con el control del apetito, algunos grupos han estudiado el papel del ADC en distintas regiones cerebrales de pacientes obesos y no obesos (16). Este estudio mostr— que, el hipot‡lamo de los pacientes obesos presenta un mayor valor de ADC, muy posiblemente debido a una distribuci—n neurovascular alterada de fluidos, como ocurre en el edema vasogŽnico. De hecho, se ha demostrado que la obesidad est‡ asociada a una respuesta inflamatoria cr—nica, caracterizada por una producci—n anormal de adipokinas y la activaci—n de algunas rutas de se–alizaci—n pro-inflamatorias. Esta una situaci—n produce la inducci—n de varios marcadores de inflamaci—n (56) y que apoya las evidencias de que las dietas de alto contenido cal—rico activan respuestas proinflamatorias en el hipot‡lamo (57,58). Esto sugiere que las respuestas inflamatorias podr’an ser las verdaderas responsables de la resistencia a insulina y leptina inducida por las dietas de alto contenido cal—rico (59,60). Adicionalmente, la inflamaci—n puede directamente da–ar el tejido cerebral, aumentando la permeabilidad de los vasos sangu’neos y causando eventualmente un incremento del nœmero de cŽlulas inflamatorias en el l’quido cefalorraqu’deo y en los espacios perivasculares en el cerebro (61).

En este sentido, un trabajo reciente (62), ha permitido determinar que los sujetos con mayor peso corporal presentan reducciones significativas en la integridad vascular de las estructuras cerebrales relacionadas con el control del apetito y los nuevos resultados de nuestro laboratorio, sugieren que la respuesta inflamatoria podr’a ocurrir no solo en la obesidad, sino tambiŽn de forma transitoria en estados de ayuno (63).

En otros estudios, se han utilizado los cambios en ADC para describir la activaci—n neuronal en seres humanos, en animales y biopsias ex vivo (15, 64-66), asociando la disminuci—n del ADC observada a un aumento de volumen neurocelular, ligado a la activaci—n neuronal. De hecho, el aumento de volumen neurocelular causado por la activaci—n neuronal ha sido demostrado tambiŽn por otras tŽcnicas (67-69). El amplio rango de valores de difusi—n con los que se trabajaba en estos estudios, origin— la aparici—n de modelos de difusi—n m‡s elaborados, como el biexponencial (70).

Interesantemente, otros estudios demostraron que el cambio de se–al de difusi—n tras activaci—n neuronal se produce antes que el cambio detectado mediante las tŽcnicas BOLD (65,71).

En este contexto, la primera aplicaci—n fDWI al estudio del control del apetito, fue publicada recientemente por nuestro laboratorio (63). Nuestros resultados mostraron que los coeficientes de difusi—n del agua en el hipot‡lamo cambian en situaciones de ayuno, tanto en ratones como en seres humanos. En ratones, fue posible detectar cambios en los nœcleos ARC, DMN y VMN. Sobre esta base, es posible afirmar que la aplicaci—n de fDWI al estudio de la activaci—n cerebral en general, y de la hipotal‡mica en particular, abre un nuevo camino en neuroimagen funcional; donde los cambios detectados mediante las tŽcnicas de difusi—n ocurren anteriormente a los detectados en BOLD (70), evitando adem‡s el uso potencialmente t—xico de las tŽcnicas MEMRI. Adem‡s, la capacidad de DWI de detectar diferencias en la direcci—n preferencial de la difusi—n mediante la implementaci—n de medidas del tensor de difusi—n (DTI) (72,73) permitir‡ en el futuro, la investigaci—n no invasiva de tractos neuronales espec’ficos y sus posibles alteraciones en desordenes del apetito.

 

Figura 4.- Representaci—n del apetito mediante fDWI en los nœcleos hipotal‡micos del cerebro de rat—n. A: Secci—n axial que contiene el hipot‡lamo de un rat—n representativo y un inserto de un atlas anat—mico que muestra la localizaci—n de los nœcleos; DMN (rojo), VMN (amarillo) y ARC (azul). B, D, F, H: Mapas de color de la difusi—n en ratones alimentados (izquierda) y ayunados (derecha), superpuestos a im‡genes pesadas en T2 (T2w). La regi—n hipotal‡mica se muestra expandida en los correspondientes paneles inferiores. C, E, G, I: Gr‡ficos de barras del promedio del coeficiente de difusi—n lenta (Dslow) correspondiente a cada uno de los paneles B, D, F, H, respectivamente. Reproducido de (63) con permiso de la revista.

La Figura 4 muestra un ejemplo representativo del uso de fDWI en el estudio de activaci—n hipotal‡mica en ratones, mediante los cambios observados en los par‡metros de difusi—n del agua en distintos nœcleos hipotal‡micos, incluyendo el ARC, VMN y DMN, cuya localizaci—n anat—mica puede observarse en detalle en el panel 5A. Los paneles 5B, 5D, 5F y 5H muestran los mapas paramŽtricos del coeficiente lento de la difusi—n (Dslow) de un animal representativo en estado alimentado (izquierda) y tras un ayuno nocturno (derecha) en el hipot‡lamo, ARC, VMN y ARC, respectivamente. Los gr‡ficos de barras en los paneles 5C, 5E, 5G y 5I representan los valores promedio del par‡metro correspondiente en siete animales. El incremento significativo de Dslow con el ayuno se puede interpretar como consecuencia del incremento de volumen celular consecuencia de la activaci—n neuronal (60).

4. Estudios de MRS de la Regulaci—n Hipotal‡mica del Apetito

Los mŽtodos de imagen pueden ser completados por varias tŽcnicas espectrosc—picas, principalmente in vivo 1H MRS y ex vivo 1H y 13C HRMAS. Estos mŽtodos han demostrado, recientemente, haber superado las restricciones que imped’an previamente evaluar adecuadamente la fisiolog’a hipotal‡mica, principalmente por la necesidad de utilizar grandes volœmenes de tejido para alcanzar suficiente resoluci—n.

In vivo 1H MRS de alto campo

Figura 5.- Espectroscop’a multinuclear del hipot‡lamo. Izquierda: Espectroscop’a in vivo de 1H en el hipocampo (paneles superiores) y en el hipot‡lamo (paneles inferiores) y sus correspondientes espectros. N—tese los incrementos relativos de GABA y myo-inositol (flecha hacia arriba) y decrecimientos de glutamato y taurina (flecha hacia abajo). Reproducido de (75) con permiso de la revista. Derecha: Espectro de 13C HRMAS de biopsias hipotal‡micas (arriba) preparado despuŽs de la administraci—n de [1-13C] glucosa, comparado con el resto del cerebro (abajo) en un rat—n ayunado. Reproducido de (80) con permiso de la revista.

La espectroscop’a de 1H MRS de alto campo (14.1T) se ha utilizado para obtener perfiles metab—licos de elevada calidad en el hipot‡lamo de rat—n in vivo (74,75). Los autores describieron que el perfil metab—lico del hipot‡lamo es diferente del de otras estructuras cerebrales como el hipocampo.

En particular, el hipot‡lamo contiene concentraciones m‡s altas de ‡cido γ-aminobut’rico (GABA) y myo-inositol, y menores concentraciones de taurina (Figura 5A). Por otro lado, la espectroscop’a de 1H alto campo tambiŽn se ha utilizado de forma combinada con tŽcnicas de imagen (52). En este caso, los autores estudiaron la activaci—n hipotal‡mica en ratas mediante el paradigma de Anorexia Inducida por Deshidrataci—n (DIA), en ratas ayunadas una noche y en ratas control. El contraste de Mn2+ detect— activaci—n neuronal en dos nœcleos hipotal‡micos: en el hipot‡lamo lateral (LH) y en el Periventricular (PVN), revelando una activaci—n superior en las ratas con DIA. Por otro lado, en el perfil metab—lico analizado con espectroscopia a 14.1T, se encontraron incrementos significativos de GABA en las dos condiciones respecto a las ratas control, mientras que el lactato aument— solamente en las ratas DIA. En su conjunto, estos estudios muestran como la espectroscopia de alto campo in vivo acoplada con MEMRI, puede proporcionar una informaci—n muy relevante sobre los mecanismos hipotal‡micos de control del apetito, balance energŽtico global y control de peso en roedores.

Espectroscop’a 13C y 1H de alto campo en ‡ngulo m‡gico

La espectroscop’a de 13C es un mŽtodo que ha mostrado un gran potencial en la investigaci—n de los mecanismos de acoplamiento neuroglial tanto in vivo como in vitro (76-79). La baja abundancia natural del 13C (1,1%), sin embargo, y la baja sensibilidad del mŽtodo, impon’an la necesidad de utilizar v—xeles de tama–o relativamente grande in vivo, que exced’an significativamente las dimensiones del hipot‡lamo.

Para superar este inconveniente, nuestro laboratorio ha implementado recientemente una nueva colecci—n de mŽtodos espectrosc—picos ex vivo, concretamente la espectroscop’a de 13C alta resoluci—n de ‡ngulo m‡gico (HRMAS). Adquiriendo espectros de resonancia magnŽtica de biopsias hipotal‡micas, con la muestra inclinada 54.7 grados con respecto al campo magnŽtico est‡tico, se eliminan los acoplamientos dipolares que ensanchan las resonancias in vivo, y se obtienen espectros de alta resoluci—n de la biopsia similares a los que se obtienen en soluci—n. Notablemente, estos espectros pueden obtenerse con muestras de tan solo 5-10 mg, un tama–o similar al del hipot‡lamo en roedores. Utilizando esta tecnolog’a, se han investigado los efectos del ayuno nocturno y de la administraci—n de grelina en el perfil metab—lico, as’ como la incorporaci—n de 13C desde (1-13C) glucosa en los metabolitos hipotal‡micos (80).

Los resultados mostraron que el ayuno nocturno induce incrementos significativos en la incorporaci—n de 13C en (2-13C) GABA y (3-13C) Lactato, mientras que la infusi—n del pŽptido orexigŽnico no afect— al marcaje en 13C de los metabolitos. Estos resultados revelaron que el ayuno parece incrementar las neurotransmisiones GABAŽrgicas y la glucolisis. Sin embargo, la infusi—n de grelina no induce los mismos efectos, indicando que factores adicionales a la la grelina resultan necesarios para mimetizar la compleja respuesta hipotal‡mica.

Finalmente, se han investigado recientemente los mecanismos neurogliales relacionados con la se–alizaci—n de la leptina en el hipot‡lamo, empleando ratones ob/ob, deficientes en leptina, y ratones control (50). Este estudio combin— tŽcnicas MEMRI con 1H y 13C HRMAS, empleando infusiones de (1-13C) glucosa, un sustrato principalmente neuronal, o de (2-13C) acetato, un sustrato primordialmente glial. Los ratones deficientes en leptina mostraron un contraste de Mn2+ aumentado en los nœcleos hipotal‡micos (Figura 3) y una acumulaci—n incrementada de 13C, solamente en los carbonos de glutamato y glutamina derivados de (1-13C) glucosa, pero no en los derivados de (2-13C) acetato.

El abordaje combinado MEMRI-13C HRMAS mostr— por primera vez que el incremento en la se–al MEMRI asociada a la activaci—n neuronal de las rutas orexigŽnicas, ocurre simult‡neamente con un incremento en el metabolismo oxidativo y en el ciclo gultamato-glutamina que soporta la neurotransmisi—n glutamatŽrgica. Considerando estas observaciones junto con las evidencias de aumento de neurotransmisiones GABAŽrgicas (80), los resultados parecen indicar que la estimulaci—n orexigŽnica del hipot‡lamo resulta en un incremento de neurotransmisiones GABAŽrgicas y glutamatŽrgicas, implicando un aumento de los ciclos transcelulares de glutamato-glutamina y GABA entre neuronas y astrocitos. En general, los resultados adquiridos hasta ahora indican que los eventos de transmisi—n sin‡ptica que soportan la se–alizaci—n neuroendocrina en el hipot‡lamo siguen unos mecanismos de compartimentaci—n neuroglial similares a otros tipos de activaciones sensoriales o motoras, pero bajo control hormonal.

5. Conclusiones y perspectivas futuras.

Las secciones anteriores han resumido la informaci—n obtenida sobre la funci—n hipotal‡mica de regulaci—n del apetito in vivo, utilizando tŽcnicas de imagen y espectroscop’a por Resonancia MagnŽtica. Los resultados revelan que la estimulaci—n orexigŽnica est‡ asociada a: un incremento de perfusi—n sangu’nea del hipot‡lamo como revelan las tŽcnicas BOLD, un incremento de actividad neuronal glutamatŽrgica y GABAŽrgica como revelan los estudios MEMRI y 13C HRMAS y un incremento de volumen neuroglial compatible con la acumulaci—n de iones asociada al disparo de las neuronas orexigŽnicas y a fen—menos inflamatorios, como revelan las tŽcnicas fDWI.

Estas caracter’sticas hacen que la transmisi—n neuroendocrina durante el apetito adopte mecanismos sin‡pticos similares a otras formas de estimulaci—n sensorial o motora. Sin embargo, en las sinapsis neuroendocrinas, la transmisi—n del mensaje glutamatŽrgico o GABAŽrgico, parece estar controlada principalmente por la concentraci—n sangu’nea del efector hormonal que podr’a interaccionar adicionalmente con elementos del sistema inmunitario y de la cascada inflamatoria, resultando en el sistema m‡s complejo de neuroregulaci—n que conocemos.

Por otro lado, las tŽcnicas de Resonancia MagnŽtica han permitido dise–ar un nuevo escenario para los mecanismos neuroendocrinos que subyacen a la regulaci—n del apetito. A pesar del progreso alcanzado, varios aspectos importantes permanecen aœn por esclarecer. En particular, la discriminaci—n entre neurotransmisiones activadoras e inhibidoras resulta dif’cil mediante estas metodolog’as, pues ambas conducen al mismo resultado espectrosc—pico o de imagen. Tampoco resulta posible incrementar aœn m‡s la resoluci—n espacial y temporal de la imaginer’a mejorando la resoluci—n obtenida de los nœcleos hipotal‡micos y alcanzando resoluciones celulares o subcelulares. La combinaci—n de tŽcnicas MRI o MRS con abordajes electrofisiol—gicos hipotal‡micos y la utilizaci—n de imanes de campo magnŽtico superior al actual podr’a contribuir a superar estas limitaciones.

Finalmente, los abordajes MRI y MRS descritos en esta revisi—n para la elucidaci—n de los mecanismos de regulaci—n hipotal‡mica del apetito in vivo, pueden ser f‡cilmente extendidos a otras funciones hipotal‡micas incluyendo, la sed y osmoregulaci—n, la regulaci—n de la presi—n sangu’nea, la termorregulaci—n, los ritmos circadianos y algunas manifestaciones de agresividad.

6. Agradecimientos

Los autores manifiestan su agradecimiento a D. Javier PŽrez CSIC, por su competencia en la preparaci—n de las ilustraciones.

Este trabajo ha sido financiado en parte por las ayudas: SAF-2008-01327, SAF2011-23622 del Ministerio de Econom’a y Competitividad y S2010/BMD-2349 de la Comunidad de Madrid concedidas a Sebasti‡n Cerd‡n y la beca predoctoral BES 2009-027615 del Ministerio de Econom’a y Competitividad concedida a Blanca Lizarbe.

7. abreviaturas

ARC:nœcleo Arcuado, AgRP: Agouti related protein, BOLD: Contraste en Imagen por Resonancia MagnŽtica ponderada en el nivel de oxigenaci—n de la sangre, CART: transcrito regulado por coca’na y anfetamina, DIA: Anorexia inducida por deshidrataci—n, DMD: nœcleo dorsomedial, DWI: Imagen por Resonancia MagnŽtica ponderada en difusi—n, MEMRI: Imagen por Resonancia MagnŽtica ponderada en captaci—n de manganeso, MRI: Imagen por Resonancia MagnŽtica, MRS: Espectroscop’a por Resonancia MagnŽtica, MSH: ruta de la melanocortina, NPY: neuropŽptido Y, VMN: nœcleo Ventromedial, V4: cuarto ventr’culo.

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