REVISIîN

Presente y Futuro en el Descubrimiento de F‡rmacos para la Enfermedad de Chagas

Nuria E. Campillo, Pedro Gonz‡lez-Naranjo, Juan Antonio P‡ez*

Instituto de Qu’mica MŽdica. CSIC. Juan de la Cierva 3, 28006-Madrid. Espa–a.

Recibido el 31 de octubre de 2011.

e-mail: jpaez@iqm.csic.es

RESUMEN

La enfermedad de Chagas, tambiŽn conocida como Tripanosomiasis Americana es una enfermedad parasitaria causada por el Trypanosoma cruzi. Se estima que alrededor de 7,7 millones de personas se encuentran infectadas y padecen la enfermedad de Chagas. Esta enfermedad silenciosa que esta estrechamente relacionada con la pobreza, es transmitida a los humanos por unos insectos que se encuentran exclusivamente en el continente americano, principalmente en ‡reas rurales con muy deficientes condiciones de salubridad. Los f‡rmacos existentes (nifurtimox y benznidazol), no siempre disponibles, constituyen un tratamiento paliativo, pero no curan la enfermedad y no son aceptables desde un punto de vista terapŽutico debido a sus efectos secundarios indeseables y a su falta de eficacia. Por tanto, es necesario el desarrollo urgente de nuevos tratamientos y por tanto, ser’a muy conveniente la utilizaci—n del dise–o racional en todas las etapas. El dise–o de f‡rmacos es una tarea compleja que requiere la colaboraci—n interdisciplinar de muchos especialistas en diferentes campos de la ciencia. El presente trabajo describe de manera estructurada las diferentes estrategias que se han utilizado y las que se pueden utilizar en el futuro para el descubrimiento de nuevos f‡rmacos para la enfermedad de Chagas. Se recogen las estrategias m‡s cl‡sicas como el dise–o de an‡logos, el cribado sistem‡tico o el basado en la informaci—n biol—gica y los mŽtodos m‡s novedosos basados en lo que se conoce como quimioinform‡tica.

Palabras clave: Enfermedad de Chagas; T. cruzi; QSAR; Quimioinform‡tica; Cribado virtual; Redes neuronales; Anclaje.

ABSTRACT

The Present and Future of Drug Discovery for Chagas Disease

Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, is caused by infection with the Trypanosoma cruzi. The Pan American Health Organization (PAHO) estimates that 7.7 million persons currently have T. cruzi infection in the 21 endemic countries. This disease can be transmitted to humans by insect vectors that are found only in the American continent, mainly, in rural areas with unhealthy housing conditions where poverty is a general concern. Nifurtimox and benznidazole are the only drugs used against this disease, but sometimes they are not available. The treatment of Chagas disease with nifurtimox or benznidazole is unsatisfactory because of their limited efficacy on the prevalent chronic stage of the disease and their toxic side effects. It is, therefore, necessary the development of new effective antichagasic drugs for the suitable treatment of this disease. The development of new drugs for Chagas disease requires a multidisciplinary approach involving diverse disciplines such as molecular and cellular biology, chemistry, bioinformatics, biochemistry, pharmacology and toxicology. This revision describes the different strategies used for drug discovery on Chagas disease treatment. The most classic strategies as the design of analogous, the systematic screening or that one based on the biological information, together the most recent methods based on chemiinformatics, are presented.

Keywords: Chagas Disease; T. cruzi; QSAR; Cheminformatics; Virtual screening; Neural network; Docking.

1. introducciÓn

La enfermedad de Chagas, tambiŽn llamada Tripanosomiasis Americana es una enfermedad parasitaria causada por un protozoo flagelado llamado Trypanosoma cruzi. Este par‡sito es transmitido a los huŽspedes vertebrados por un insecto hemat—fago, el Triatoma infestans, conocido como vinchuca o chinche. La enfermedad de Chagas tambiŽn puede transmitirse a travŽs de transfusiones de sangre, de madres a hijos durante el embarazo, o con menos frecuencia, a travŽs de trasplantes de —rganos o alimentos contaminados. El par‡sito se reproduce en los tejidos internos y causa problemas en el coraz—n, el es—fago, el colon y el sistema nervioso (1).

Esta enfermedad es una endemia parasitaria que afecta a unos 7,7 millones de personas en LatinoamŽrica, extendiŽndose desde el sur de los Estados Unidos hasta Argentina y Chile. No existe vacuna contra la enfermedad de Chagas y las personas afectadas pueden volverse a infectar despuŽs de recibir tratamiento farmacol—gico (2).

El hecho de que la enfermedad de Chagas estŽ ’ntimamente relacionada con la pobreza ha podido ser una de las razones que ha originado la falta de interŽs en el desarrollo de nuevos medicamentos eficaces. Esto explica que se sigan utilizando f‡rmacos que fueron comercializados en los a–os 70, como el nifurtimox y el benznidazol que no est‡n aprobados por la FDA (Federal Drug Administration). En la actualidad, esta enfermedad est‡ clasificada por la Organizaci—n Mundial de la Salud como una enfermedad extremadamente olvidada (3).

El dise–o de nuevos f‡rmacos es una tarea compleja que requiere la colaboraci—n interdisciplinar de muchos especialistas en diferentes campos de la ciencia. En el descubrimiento de nuevos f‡rmacos hay que considerar, adem‡s de las propiedades farmacol—gicas, otros aspectos de gran relevancia, como es el de las propiedades ADMET (A: absorci—n, D: distribuci—n, M: metabolismo, E: excreci—n y T: toxicidad). Por tanto, antes de tomar en consideraci—n a un nuevo cabeza de serie (lead compound) de acuerdo a sus propiedades farmacol—gicas es necesario que se incluya un estudio m‡s profundo de las propiedades ADMET del hit.

2. DiseÑo de FÁrmacos

El dise–o de nuevos f‡rmacos para la enfermedad de Chagas puede abordarse mediante dos estrategias generales. La primera consiste en el aislamiento y estudio de productos naturales procedentes de la medicina tradicional o de otras fuentes y la segunda, se refiere al desarrollo de nuevos compuestos de s’ntesis qu’mica o de procedencia biotecnol—gica (4, 5).

El uso de productos naturales como estrategia en la bœsqueda de nuevos hits para la enfermedad de Chagas se ha realizado fundamentalmente en productos naturales de origen vegetal, aunque tambiŽn se han aislado algunos compuestos a partir de hongos o de especie marinas. Existen numerosas revisiones recientes que recogen los trabajos realizados en este campo (6-9). ònicamente citar algunas de las familias estudiadas y de las que se han encontrado molŽculas activas como las leguminosas o fab‡ceas (Cassia fistula, Harpalyce brasiliana, Pterodon pubescens (10), solan‡ceas (Acnist arborescens, Physalis angulata)boragin‡ceas (Cordia globosa), clusi‡ceas (Mammea americana) (11) y diversas especies de la familia de las piper‡ceas (Piper glabratum, P. acutifolium (12); P. gaudichaudianum, P. aduncum (13); P. crassinervium (13, 14), Peperomia blanda (15).

A partir de estas especies naturales han sido aisladas y caracterizadas una gran variedad de estructuras qu’micas con propiedades anti-T. cruzi (8). De entre todas ellos podemos citar como m‡s representativas a los flavonoides como chalconas, flavonas o isoflavonas; terpenoides como derivados de diterpenos (icetexano, labdano, azorellano), triterpenos pentac’clicos o lactonas sesquiterpŽnicas; lignanos; cumarinas; catequinas; xantonas; arilfloroglucinoles; antraquinonas y naftilisoquinolinas (6-8) (Figura 1). Finalmente, mencionar que tambiŽn se han obtenido derivados anti-T. cruzi aislados a partir de esponjas marinas (Agelas sp.) (16) y hongos (Basidiomycota fungi) (17).

Figura 1.- Ejemplos representativos de productos naturales derivados de xantona (18), antraquinona (19), diterpeno (20), isoflavona (21) pterocarpano, chalcona (22), lignano (15), cumarina (11), cromeno (13).

Una estrategia m‡s reciente utilizada en la bœsqueda de nuevos hits es la que se refiere a la qu’mica combinatoria. Esta tŽcnica fue desarrollada originalmente para la obtenci—n de librer’as con un nœmero elevado de compuestos y para su posterior evaluaci—n en diferentes dianas utilizando tŽcnicas de HTS (high-throughput screening; acr—nimo inglŽs de cribado de alto rendimiento). La aproximaci—n inicial de la realizaci—n del cribado de alto rendimiento a miles de compuestos tiene bastantes detractores y la tendencia actual es la obtenci—n de librer’as m‡s peque–as de compuestos bien caracterizados.

Una clasificaci—n m‡s sistem‡tica para el dise–o de f‡rmacos, basada en la metodolog’a utilizada, podr’a establecerse en cuatro grandes apartados: dise–o de an‡logos, dise–o basado en cribado (screening) sistem‡tico, dise–o basado en informaci—n biol—gica y quimioinform‡tica (Figura 2).

Figura 2.- Esquema general representativo en el dise–o de f‡rmacos.

2.1. Dise–o de An‡logos

Una de las estrategias m‡s utilizadas para la obtenci—n de derivados anti-T. cruzi ha sido el dise–o de an‡logos de molŽculas de probada actividad. Mediante esta estrategia molŽculas con actividad biol—gica son modificadas para incrementar su potencia, su especificidad, mejorar su toxicidad, etc.

Desde el descubrimiento de la tripanosomiasis americana por Carlos Chagas en 1909 (23), un gran nœmero de compuestos han sido sometidos a evaluaci—n con el objetivo de encontrar molŽculas que fueran activas frente al Tripanosoma cruzi. Entre las familias de derivados estudiadas se pueden citar derivados de fenotiazinas, acridinas, fenazinas, imidazoles, nitroimidazoles, triazoles, nitroimidazoles, tiadiazoles, isoxazoles, purinas, naftoquinonas, indoles, isoquinolinas, nitrofuranos, naftoquinonas, complejos met‡licos etc. Las investigaciones realizadas utilizando mŽtodos emp’ricos condujeron al descubrimiento de un nitrofurano (nifurtimox, Lampit) y un nitroimidazol (benznidazol; Rochagan), que son los dos compuestos heteroc’clicos comercializados en 1972 y 1974, respectivamente (1). Ninguno de los dos est‡ aprobado por la FDA (Food and Drug Administration)(24) por lo que en Estados Unidos solo est‡n disponibles a travŽs de la CDC (Centers for Disease Control and Prevention) (25).

Desde entonces, se han preparado cientos de an‡logos correspondientes a diferentes familias, algunas de los cuales han mostrado interesantes propiedades anti-T. cruzi (Figura 3). Se pueden citar derivados de 5-nitrofurilo, 5-nitrotienilo; furoxanilo, benzofuroxanilo (26, 27); quinoxalinilo, imidazolilo o benzimidazolilo, indazolilo, (28), imidazolidinas (29), imidazo[4,5-c][1,2,6]tiadiazinas (30), imidazo[1,2-b]isoquinolinas (31). Otras familias descritas con propiedades anti-T. cruzi corresponden a N-—xidos de furoxano o benzofuroxano, imidazol o benzimidazol, indazol o quinoxalina (32, 33).

2.2. Dise–o Basado en Cribado Sistem‡tico

Este mŽtodo consiste en someter a las nuevas molŽculas objeto de estudio, bien sean de procedencia sintŽtica o de origen natural, a evaluaci—n farmacol—gica utilizando cualquier prueba biol—gica, sin una hip—tesis previa. Se basa en el uso sistem‡tico de bater’as de test en cualquier modelo experimental, si bien la tendencia actual es utilizar pruebas in vitro, ensayos de anclaje (binding), inhibici—n enzim‡tica, —rganos aislados, cultivos celulares, etc. El cribado puede hacerse ensayando un peque–o nœmero de molŽculas, qu’micamente sofisticadas y novedosas, a una serie de pruebas biol—gicas o llevarse a cabo al azar buscando un hit entre centenares de molŽculas. Una estrategia frecuentemente utilizada es la de incluir intermedios sintŽticos, ya que en general, en las rutas de s’ntesis utilizadas para la s’ntesis de los compuestos objetivo, es necesario la preparaci—n previa de productos intermedios que guardan una cierta similitud estructural con los compuestos finales.

Figura 3.- Ejemplos representativos de derivados anti-T. cruzi.

Desde los a–os 80, con los avances de la rob—tica y de la miniaturizaci—n de los mŽtodos de ensayos in vitro, en el HTS se han producido grandes avances con la introducci—n de estas mejoras. Este mŽtodo se aplica utilizando tŽcnicas de evaluaci—n por desplazamiento de radioligandos o mediante procesos de inhibici—n enzim‡tica. En la actualidad, la tendencia es sustituir los ensayos de radioligandos por ensayos de fluorescencia.

Las estrategias de screening que corresponden a mŽtodos emp’ricos han sido las m‡s utilizadas para el descubrimiento de nuevos prototipos en la bœsqueda de compuestos anti- T. cruzi. Estas estrategias, aunque son aparentemente menos racionales, siguen siendo muy œtiles para el descubrimiento de nuevos compuestos tripanomicidas, debido fundamentalmente al desarrollo y mejora de los ensayos in vitro en cepas de Tripanosoma cruzi.

El mŽtodo de HTS que es ampliamente utilizado en la industria biofarmacŽutica, ha sido poco aplicado en la bœsqueda de nuevos f‡rmacos para la enfermedad de Chagas. Uno de los m‡s interesantes corresponde a un trabajo en el que utilizando una biblioteca qu’mica de 2000 compuestos, se describen 3 nuevos derivados (Figura 4) que inhiben la replicaci—n intracelular de amastigotes en el rango nM, con una baja toxicidad (34).

2.3. Dise–o Basado en Informaci—n Biol—gica

Esta estrategia se basa en la observaci—n de efectos biol—gicos en humanos, en animales, en vegetales o en microorganismos. La procedencia de estos datos puede proceder de fuentes muy diversas como: 1) estudio de medicinas ind’genas; 2) observaciones cl’nicas de los efectos adversos o secundarios de medicinas; 3) nuevos usos para medicamentos ya utilizados para otras dolencias; 4) observaciones fortuitas de molŽculas usadas en la industria.

Figura 4.- Nuevos prototipos anti-T. cruzi descritos mediante un estudio HTS.

En este sentido, distintos principios activos han sido evaluados en este campo. Se pueden citar algunos que han sido estudiados sin buenos resultados, como los antibi—ticos, actinomicina D (35) o amfotericina B (36). Sin embargo, estudios en antifœngicos como el ketoconazol han demostrado efectividad en tejidos infectados en fase aguda, aunque con poca efectividad en fase cr—nica (37, 38). Menci—n aparte merece un an‡logo como el itraconazol (Figura 5), antifœngico perteneciente a la familia de los triazoles que est‡ indicado en micosis superficiales y profundas. Este f‡rmaco ejerce su efecto alterando la membrana celular del hongo mediante la inhibici—n de la s’ntesis del ergosterol interaccionando con la 14-a-desmetilasa, una enzima del citocromo P450 que es necesaria para la conversi—n del lanosterol a ergosterol. En el caso del itraconazol los estudios realizados en adultos demostraron una curaci—n parasitol—gica en el 20% de los enfermos estudiados, con un 50% de mejor’a de las alteraciones electrocardiogr‡ficas (39). Otro caso interesante es el alopurinol (inhibidor de la bios’ntesis de purinas) que si bien no es eficaz en el tratamiento de pacientes en fase aguda si presenta efecto en pacientes cr—nicos (Figura 5). Estudios comparativos con benznidazol y nifurtimox, mostraron menos efectos adversos en el grupo tratado con alopurinol (39). Estos compuestos si bien han mostrado utilidad en algunos de los casos estudiados (25, 39-41) deben de ser objeto de m‡s investigaciones con protocolos m‡s rigurosos en un mayor nœmero de pacientes.

2.4. Quimioinform‡tica

La quimioinform‡tica combina los recursos de la informaci—n, para transformar datos en informaci—n e informaci—n en conocimiento, con el objetivo de encontrar nuevos hits o para la optimizaci—n de los mismos, de manera m‡s cient’fica y racional, con el consiguiente ahorro de tiempo y de recursos econ—micos (42). Las estrategias generales para el dise–o racional de f‡rmacos se pueden plantear dependiendo del conocimiento o desconocimiento de la estructura tridimensional del receptor o diana.

Figura 5.- Estructuras de medicamentos con actividad antichag‡sica.

2.4.1. Dise–o basado en las molŽculas bioactivas

Esta estrategia se basa en el estudio de molŽculas cuyas propiedades farmacol—gicas han sido previamente demostradas y consiste en la bœsqueda de elementos comunes, bien sean estructurales o relacionados con sus propiedades fisicoqu’micas. Se pueden considerar diferentes modelos que se describen a continuaci—n, dependiendo fundamentalmente de considerar propiedades 2D o 3D.

2.4.1.1. Modelo QSAR (relaciones estructura-actividad cuantitativa)

Para el establecimiento de un modelo QSAR, es necesario en primer lugar definir las molŽculas mediante valores numŽricos. Existen diferentes aproximaciones que se pueden considerar para la descripci—n de las estructuras bien sea mediante par‡metros cl‡sicos, definidos en funci—n de criterios electr—nicos, estŽricos o hidrof—bicos o mediante descriptores que son calculados a partir de la representaci—n de la estructura en dos o en tres dimensiones.

En general, los qu’micos representan las molŽculas en dos dimensiones mediante un gr‡fico. Sin embargo, tambiŽn pueden ser representadas por una serie de caracteres unidos y ordenados. Los m‡s utilizados son el c—digo SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) o el InChI (International Chemical Identifier).

La representaci—n de la estructura tridimensional de una molŽcula es mucho m‡s compleja, si bien tanto la geometr’a como las propiedades asociadas puede ser establecida mediante c‡lculos de mec‡nica molecular o de mec‡nica cu‡ntica (43-45) (mŽtodos DFT, ab initio, semiemp’ricos). La elecci—n de uno u otro mŽtodo depende fundamentalmente del tama–o de la molŽcula, de la naturaleza del problema planteado y del tiempo de c‡lculo requerido.

Otro aspecto importante es el mŽtodo matem‡tico usado en la bœsqueda de modelos de predicci—n. El mŽtodo MLR (Multiple Lineal Regresion) (46, 47) que fue uno de los primeros en utilizarse a principios de los a–os noventa, permite encontrar relaciones lineales entre las propiedades observadas y un conjunto de descriptores. El principal problema radica en el hecho de que el nœmero de molŽculas usadas debe ser muy superior al nœmero de descriptores empleados, y en que los descriptores o variables no independientes se traducen en modelos con una regresi—n de mala calidad.La regresi—n parcial por m’nimos cuadrados o PLS (Partial Least Square) (47) soluciona en parte estos problemas, ya que es posible el uso de un nœmero ilimitado de descriptores y soluciona el problema de la colinealidad entre variables.

Los modelos descritos en la bibliograf’a han sido utilizados para explicar la actividad en funci—n de la estructura de series an‡logas o para el estudio de relaciones estructura actividad cuantitativa. En general, tienen m‡s interŽs acadŽmico que utilidad para la bœsqueda de nuevos prototipos estructuralmente diferentes. Los modelos publicados de estudios QSAR se han llevado a cabo con derivados de familias de semicarbazonas (48), imidazolinas (29), derivados heteroc’clicos de N-—xido (32), 5-nitrofuril semicarbazonas (49), cumarinas (50), nitrofurazonas (51), etc utilizando la actividad anti-T. cruzi. En otros casos, la actividad antichag‡sica es representativa de un proceso enzim‡tico como la inhibici—n de la Tripanotiona reductasa (51, 52) o de la cruzipa’na (48, 53).

Estos modelos han utilizado diferentes tipos de descriptores que incluyen tanto par‡metros cl‡sicos, como otros obtenidos mediante qu’mica cu‡ntica (29, 31, 54, 55). Las estrategias matem‡ticas m‡s utilizados en el desarrollo de estos modelos corresponden a mŽtodos de regresi—n lineal mœltiple, si bien tambiŽn han sido usados mŽtodos no lineales (32, 48, 56). Un ejemplo que puede aplicarse para la predicci—n de nuevas molŽculas (52), se refiere al desarrollo de un modelo cualitativo que mediante un an‡lisis discriminante, permite diferenciar los compuestos activos/inactivos frente a la inhibici—n de la Tripanotiona reductasa (IC50) con un 90% y 89% de aciertos, en el conjunto de entrenamiento y validaci—n, respectivamente. En el desarrollo del modelo se consideraron 1612 descriptores (geomŽtricos y topol—gicos) y se estableci— un modelo validado con 35 estructuras.

2.4.1.2. Redes neuronales artificiales

En el siglo XXI se ha incrementado la utilizaci—n de la inteligencia artificial, metodolog’a basada en aproximaciones matem‡ticas no lineales. Este tipo de mŽtodos consiguen simular procesos biol—gicos, ya sean cambios evolutivos o mutaciones en el caso de los algoritmos genŽticos (57, 58) o el comportamiento de las redes neuronales biol—gicas en el caso de las RNA (redes neuronales artificiales) (59-62).

Una red neuronal artificial es un modelo de procesamiento de la informaci—n inspirado en el funcionamiento del sistema nervioso biol—gico y trata por tanto, de reproducir las caracter’sticas del cerebro humano. La estructura de este sistema de procesamiento se compone de un gran nœmero de elementos interconectados (neuronas) que procesan la informaci—n recibida. El funcionamiento de una red neuronal depende de la arquitectura, del tipo de conexi—n entre las neuronas, y del mecanismo de aprendizaje (63) empleado en el proceso de entrenamiento.

Durante el proceso de aprendizaje la red neuronal puede modificar los pesos de las interconexiones en respuesta a los datos de entrada atendiendo a diferentes criterios (64). En el aprendizaje supervisado el proceso se realiza mediante un entrenamiento controlado por un agente externo (supervisor o maestro) que determina la respuesta que deber’a generar la red a partir de los datos de entrada. En el aprendizaje no supervisado, la red no requiere de la influencia externa para ajustar los pesos de las conexiones entre sus neuronas y por tanto, no recibe ninguna informaci—n por parte del entorno que le indique si la salida generada en respuesta a una entrada es o no correcta. Este tipo de redes son capaces de autoorganizarse, buscando las caracter’sticas, regularidades o patrones que se pueden establecer entre los datos de entrada.

Un ejemplo de aplicaci—n de esta metodolog’a ha sido realizada en 46 cetonas en las que se ha establecido un modelo de correlaci—n con la constante de inhibici—n de la cruzipa’na mediante una red neuronal siguiendo el mŽtodo de regulaci—n Bayesiana (65).

Otra estrategia diferente basada en redes neuronales artificiales que permite la predicci—n de la actividad anti-T. cruzi de cualquier tipo de molŽcula ha sido descrita por nuestro grupo de trabajo (66). Este procedimiento est‡ basado ’ntegramente en la utilizaci—n de redes neuronales artificiales tanto en el proceso de definici—n de las molŽculas como en el modelo de predicci—n. La metodolog’a desarrollada para la obtenci—n del modelo matem‡tico, consiste en varias etapas (Figura 6).

Un conjunto representativo de 72 compuestos obtenidos de Cerecetto y col. (33) con diversidad tanto estructural como biol—gica fue seleccionado para el estudio. Teniendo en cuenta el porcentaje de la inhibici—n del crecimiento, la definici—n de las molŽculas fue realizada mediante una red neuronal no supervisada utilizando el programa CODES¨ (67). CODESñ genera descriptores topol—gicos de las estructuras mediante una red neuronal basada en un modelo de activaci—n y competici—n interactiva (IAC) a partir de las estructuras graficas. CODESñ parte de la representaci—n gr‡fica de la molŽcula, generando el correspondiente espacio topol—gico que posteriormente es trasladado a un espacio neuronal (red neuronal isomorfa). Para cada molŽcula, CODESñ genera un vector numŽrico con tantos elementos (descriptores) como ‡tomos tenga la molŽcula. Puesto que el procesamiento de esta RNA es secuencial, para cada subproceso o iteraci—n se generar‡ un vector de actividad. El conjunto de todos estos vectores constituye una matriz din‡mica, con tantas columnas como ‡tomos tenga la molŽcula y cuyo œltimo vector representa el estado de equilibrio del proceso.

La reducci—n de dimensiones de cada matriz din‡mica (las estructuras quedan codificadas en cuatro descriptores) se realiza mediante una red neuronal de retropropagaci—n del error y es necesaria para no perder la informaci—n de la matriz din‡mica de CODES y para que el nœmero de variables sea el mismo para todas las molŽculas. Durante el entrenamiento de la red se estudian diferentes arquitecturas utilizando una red de retropropagaci—n del error mediante un aprendizaje supervisado, ya que cada molŽcula de la serie de entrenamiento va asociada con su valor de actividad.

Siguiendo esta metodolog’a se ha desarrollado una red neuronal (68) de arquitectura 4-4-1, a partir de 37 compuestos que presenta una capacidad de predicci—n del 78% en el test de validaci—n externa (35 compuestos) (Figura 7).

Las ventajas m‡s destacables de esta metodolog’a son: a) se puede aplicar a conjuntos de molŽculas quimio- y biodiversas; b) no es necesario conocer la estructura tridimensional de los m’nimos conformacionales; c) no es necesaria una selecci—n previa de par‡metros para definir las molŽculas; d) es aplicable a molŽculas quirales.

Figura 6.- Procedimiento para el establecimiento de una red neuronal para la predicci—n de la actividad antichag‡sica.

Esta metodolog’a proporciona una herramienta de gran utilidad ya que la red final es capaz de estimar la inhibici—n del crecimiento parasitario de familias estructurales quimiodiversas de manera r‡pida y eficaz, lo que permite evitar costes innecesarios en el desarrollo de nuevos compuestos con potencialidad terapŽutica.

 

 

 

Figura 7.- Esquema de la red neuronal para la predicci—n de la actividad anti-T. cruzi (porcentaje de inhibici—n del crecimiento del par‡sito, PIC).

2.4.1.3. Modelo de farmac—foro

Los requerimientos estŽricos y electr—nicos m’nimos indispensables de una molŽcula para lograr la uni—n al receptor y originar una respuesta farmacol—gica es lo que constituye el concepto de farmac—foro (69) (Figura 8). Sin embargo, la presencia de un farmac—foro en cualquier estructura qu’mica no es condici—n suficiente para esperar una respuesta farmacol—gica.

Figura 8.- Farmac—foro de los inhibidores de TcHx (adaptado de (70)).

El procedimiento seguido para el dise–o de un farmac—foro comienza con la bœsqueda de la conformaci—n bioactiva, mediante tŽcnicas de exploraci—n del espacio conformacional. El segundo paso consiste en un proceso de superposici—n estructural de las molŽculas consideradas. Y por ultimo, el establecimiento de los requerimientos m’nimos que tiene que cumplir una molŽcula para interaccionar con la diana biol—gica propuesta. Este tipo de estudio necesita de un an‡lisis conformacional riguroso de cada una de las molŽculas a analizar, porque es posible que la conformaci—n bioactiva del f‡rmaco no sea la m‡s estable termodin‡micamente. Algunos de los programas m‡s utilizados en la elucidaci—n del farmac—foro son Catalyst (71), Galahad (72) y Gasp (73).

2.4.1.4. Modelo 3D-QSAR

El 3D-QSAR considera la naturaleza tridimensional de las molŽculas, asumiendo que la interacci—n molŽcula-receptor puede ser representada por un conjunto de interacciones estŽricas y electrost‡ticas, entre la molŽcula a estudiar y un Ò‡tomo sondaÓ. Estas interacciones se conocen como MIP (Molecular Interaction Potential). Estad’sticamente, no se trata de un modelo lineal como en el dimensional ya que vamos a tener una gran cantidad de variables, por tanto no se puede utilizar como herramienta estad’stica una regresi—n, sino que es necesario aplicar otras tŽcnicas que permitan disminuir el nœmero de variables (PLS).

Los mŽtodos 3D-QSAR m‡s utilizados son CoMFA (74, 75), CoMSIA (76, 77) y GRID/GOLPE (78). La principal diferencia entre estos mŽtodos es el tipo de descriptores que usan: los mŽtodos CoMFA y CoMSIA calculan diferentes campos de interacci—n molecular, estŽricos, electrost‡ticos, hidrof—bicos. El mŽtodo GRID/GOLPE permite calcular un campo para cada sonda qu’mica implementada en el programa GRID, que utiliza aproximaciones de mec‡nica molecular.

Un ejemplo interesante de la aplicaci—n de estas tŽcnicas se puede encontrar en el dise–o de inhibidores de la enzima hexoquinasa (HK) (70). La hexoquinasa es la primera enzima involucrada en la glic—lisis de muchos organismos, entre los que se incluye el agente etiol—gico de la enfermedad de Chagas, T. cruzi.

Figura 9.- Procedimiento empleado para el desarrollo de bisfosfonatos como inhibidores de la enzima hexoquinasa de T. cruzi (TcHK).

En base a estudios previos que mostraban que an‡logos de los bisfosfonatos eran potentes inhibidores de la hexoquinasa de T. cruzi, y haciendo uso de las herramientas antes comentadas como la construcci—n de un modelo de farmac—foro y estudios 3D-QSAR (CoMSIA) se ha explicado la actividad de los derivados de bisfosfonatos frente a la enzima hexoquinasa de T. cruzi y se han dise–ado nuevos an‡logos (Figuras 9 y 10).

Figura 10.- Ejemplo de bisfosfonatos estudiados.

El modelo de farmac—foro construido con 17 compuestos activos considerando hasta un m‡ximo de 256 conformaciones por cada compuesto, permiti— confirmar la hip—tesis de partida donde se presupon’a que se necesitaban 2 grupos negativos ionizables, 2 grupos hidrof—bicos y un grupo arom‡tico neutro (Figura 11).

Figura 11.- Modelo de farmac—foro para la inhibici—n de TcHK.

El estudio 3D-QSAR se llev— a cabo con el programa CoMSIA, que calcula ’ndices de similitud bas‡ndose en la interacciones (hidrof—bicas, electrost‡ticas y estŽricas) entre una molŽcula y un ‡tomo prueba, para posteriormente correlacionar dichos ’ndices con la actividad. Los pasos seguidos en el estudio tridimensional se pueden resumir en los siguientes puntos: i) alineamiento del grupo de entrenamiento usando el patr—n (H)O-PC-P-O(H); ii) c‡lculo de las interacciones de cada molŽcula del conjunto de entrenamiento con un ‡tomo prueba (‡tomo sp3 C); iii) an‡lisis cuantitativo empleando PLS. Los resultados derivados del estudio 3D-QSAR (CoMSIA) pusieron de manifiesto que la contribuci—n electrost‡tica es m‡s importante que la hidrof—bica o la estŽrica (43% frente al 24% y 13 % respectivamente) (Figura 12).

Figura 12.- Esquema de la contribuci—n de las diferentes interacciones. El color rojo indica interacciones desfavorables.

De acuerdo con los resultados obtenidos se puede explicar por quŽ algunos bisfosfonatos que inhiben la enzima farnesil difosfato sintetasa (FPPS), no son inhibidores de la enzima TcHK. Para que un compuesto cumpla las condiciones en el modelo de farmac—foro de los inhibidores de FPPS es necesario una carga positiva, mientras que en el modelo de farmac—foro de los inhibidores de TcHK los puntos claves son grupos voluminosos y cadenas no cargadas (Figura 12 ).

2.4.2. Dise–o basado en la estructura tridimensional de la diana. Estudio de las interacciones f‡rmaco-receptor

Una gran variedad de procesos fisiol—gicos son la consecuencia de la interacci—n entre ligandos y macromolŽculas. Conociendo la estructura de una determinada prote’na es posible encontrar ligandos que puedan modificar la funci—n de dicha prote’na. Estas dianas pueden ser enzimas, receptores, canales de iones, prote’nas de transporte o DNA. En general los f‡rmacos que interaccionan en estas dianas actœan mediante procesos de: inhibici—n enzim‡tica, interferencia en la bios’ntesis de la pared molecular, alteraci—n del transporte en membranas celulares o mediante interacci—n con receptores de membrana o con receptores intracelulares.

La caracterizaci—n de la secuencia del genoma del T. cruzi que fue publicada en 2005 (79) y el correspondiente an‡lisis prote—mico, ha permitido la identificaci—n de caracter’sticas especificas de las diferentes etapas de su ciclo de vida (80). Desde entonces, el progreso en los conocimientos sobre su fisiolog’a, bioqu’mica, nuevas rutas biosintŽticas y las enzimas relevantes para la supervivencia del T. cruzi han sido muy relevantes y han proporcionado nuevas dianas para la exploraci—n de nuevas estrategias para la quimioterapia en la enfermedad de Chagas.

Varias estructura terciarias obtenidas mediante cristalograf’a de rayos X de enzimas de T. cruzi han sido descritas y almacenadas en la base de datos de prote’nas, PDB (protein data bank) (81). En la Tabla 1 se recogen las enzimas m‡s representativas que podr’an ser utilizadas en el dise–o de nuevos f‡rmacos contra la enfermedad de Chagas.

Tabla 1.- Dianas representativas con estructura tridimensional.

Diana

Estructuras cristalogr‡ficas

Mecanismo de acci—n

Hipoxantina fosforibosil-

transferasa (HGPRT)

1P17, 1P18, 1P19, 1I0I, 1I0L, 1I13, 1IL14, 1TC2, 1TC1

Captura de purinas y

Dihidrofolato reductasa–

Timidilato sintetasa (DHFR-TS)

2H2Q, 3CL9, 3CLB

s’ntesis de nucle—tidos

Cruzipa’na

1AIM, 1EWL, 1EWM, 1EWO, 1EWP, 1F29, 1F2A, 1F2B, 1F2C, 1ME3, 1ME4, 1U9Q, 2AIM, 2EFM, 2OUL, 2OZ2

Responsable de la actividad proteol’tica

Tripanotiona reductasa (TR)

1GXF, 1AOG, 1NDA

S’ntesis y metabolismo del tripanotiona

Farnsesil pirofosfato

Sintetasa (FPPS)

3IBA, EICK, 3ICM, 3ICN, 3ICZ, 3ID0, 1YHK, 1YHL, 1YHM

Bios’ntesis de ergosterol

Transialidasa

1MR5, 1MS0, 1MS1, 1MS3, 1MS4, 1MS5, 1MS8, 1MS9, 1S0I, 1S0J, 2AH2

Transferencia de residuos de ‡cido si‡lico

Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)

1K3T, 1ML3, 1QXS, 3DMT

V’a metab—lica de oxidaci—n de la glucosa

C14α esterol demetilasa

2WUZ, 2WXZ

Bios’ntesis de esteroles de membrana

2.4.2.2. Estudios de Anclaje

Los estudios de anclaje (docking) son una herramienta computacional muy œtil para buscar la mejor uni—n entre dos molŽculas, un receptor y un ligando, con el fin de dise–ar ligandos m‡s espec’ficos que encajen con mayor precisi—n en el sitio de uni—n de la diana terapŽutica (82-84).

En funci—n de la informaci—n experimental de la que se disponga, la predicci—n de la uni—n prote’na-ligando puede ser m‡s o menos costosa. Si se dispone de complejos cristalizados ligando-receptor, el estudio del sitio de uni—n de nuevas molŽculas resulta mucho m‡s sencillo. Por otra parte, poder disponer de datos biol—gicos experimentales como los obtenidos por mutagŽnesis dirigida, permiten deducir las interacciones entre el f‡rmaco y la prote’na. Con estas informaciones, se puede realizar un acoplamiento manual entre el ligando y el receptor mediante programas de modelizaci—n molecular para obtener as’ modelos que expliquen en lo posible los datos experimentales. Sin embargo, si no se dispone de datos experimentales (complejo 3D prote’na-ligando cristalizado, estudios de mutagŽnesis, etc), existen mŽtodos autom‡ticos para explorar las posibles uniones entre ligando y receptor. Son los denominados programas de docking, los cuales realizan una exploraci—n de todas las posibles posiciones relativas ligando-receptor evaluando la interacci—n intermolecular entre ambos mediante una funci—n de scoring (85,86)

Los mŽtodos m‡s utilizados son: i) fast shape matching (DOCK(87), EUDOCK(88), LIGANDFIT(89)), ii) construcci—n incremental del ligando en la cavidad de la prote’na (FLEXX(90)) y iii) algoritmos genŽticos (FLEXIDOCK, GOLD(91), AUTODOCK3.0(92)),

Las aplicaciones de cribado virtual (93) permiten, a partir de grandes bases de datos de estructuras qu’micas (ÒquimiotecasÓ o chemical libraries), seleccionar aquellos compuestos que presentan una mayor afinidad por la diana terapŽutica. En el cribado virtual se emplean diferentes filtros para ir reduciendo el nœmero de estructuras. Estos filtros pueden realizarse empleando descriptores moleculares o definiendo un modelo de farmac—foro.. Se requiere poseer un archivo numeroso de ligandos potenciales, esto es, molŽculas org‡nicas con estructuras tridimensionales conocidas.

Una de las quimiotecas m‡s utilizada es ZINC, que es una base de datos de libre distribuci—n (94) cuyo cat‡logo completo (2.8*106 molŽculas) incluye molŽculas de varias casas comerciales.

Un ejemplo interesante de la utilizaci—n de estos mŽtodos se aplic— en el dise–— de inhibidores de la enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (HGPRT)(98).  El Tripanosoma cruzi es deficiente en la s’ntesis de novo de las purinas, por lo que deben obtener estos compuestos esenciales del hospedero. Una enzima esencial en este proceso es la hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (HGPRT). Diferentes estructuras tridimensionales de esta enzima (95-97) han sido resueltas mediante cristalograf’a de rayos X (Tabla 1). Gracias al conocimiento de estas estructuras junto con estudios de mutaciones se ha podido describir el sitio activo en el bucle I, definido por tres residuos an‡logos en la enzima humana, Leu67, Lys68 y Gly69. Mediante cribado virtual y usando la estructura cristalogr‡fica de la HGPRT (C—digo PDB 1TC2) se identificaron 22 potenciales inhibidores, 16 de los cuales demostraron ser potentes inhibidores de la HGPRT y 3 de ellos efectivos agentes antiproliferativos in vitro contra la forma amastigote intracelular del par‡sito (Figura 13). El cribado virtual se realiz— empleando un programa de docking flexible (DOCK), enfrentando el sitio activo de la enzima HGPRT frente a la base de datos ACD (Available Chemicals Directory de MDL Information Systems, San Leandro, CA, USA).

Figura 13.- Estrategia empleada en la identificaci—n de nuevos inhibidores de HGPRT.

Otro ejemplo muy interesante de la aplicaci—n de las tŽcnicas de docking y cribado virtual al desarrollo de nuevos inhibidores de la enzima cruzipa’na ha sido publicado recientemente (99).

La cruzipa’na, una ciste’n-proteasa, es responsable de la mayor parte de la actividad proteol’tica de T. cruzi en todos los estadios de su ciclo de vida. Inhibidores selectivos de esta proteasa son capaces de bloquear la proliferaci—n tanto de la forma extracelular (epimastigotes) como de los amastigotes intracelulares, as’ como de impedir la transformaci—n de epimastigotes a tripomastigotes metac’clicos, lo que indica que la prote’na tiene funciones esenciales en el ciclo de vida del par‡sito. Ferreira y colaboradores (99) emplean de forma complementaria el cribado virtual (CV) y el cribado de alto rendimiento (HTS, high-throughput screening) de una quimioteca en busca de inhibidores reversibles y competitivos de la enzima cruzipa’na (Figura 14).

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 14.- Estrategia combinada de HTS y CV para el desarrollo de inhibidores competitivos de la enzima cruzipa’na.

3. CONCLUSIONES

La singularidad de la enfermedad de Chagas, como enfermedad ’ntimamente relacionada con la pobreza y la ausencia de salubridad han sido, entre otros, factores fundamentales en el deficiente desarrollo de nuevos medicamentos. En la actualidad se siguen utilizando f‡rmacos que fueron comercializados en los a–os 70, como el nifurtimox y el benznidazol que no est‡n aprobados por la FDA. El hecho es que esta dolencia est‡ considerada por la Organizaci—n Mundial de la Salud como una enfermedad extremadamente olvidada.

La situaci—n terapŽutica en la enfermedad de Chagas no puede explicarse de ninguna manera, ni en funci—n del estado actual del conocimiento de la enfermedad, ni de las herramientas disponibles para el dise–o de f‡rmacos, ya que son comparables con las existentes para cualquier otra enfermedad. Parece por tanto, que aunque el dise–o racional es siempre œtil y recomendable para que el descubrimiento de nuevos f‡rmacos sea sostenible, se hace m‡s indispensable, aœn si cabe, para la bœsqueda de nuevos medicamentos eficaces para la enfermedad de Chagas.

Es por tanto conveniente y deseable la utilizaci—n de todos los mŽtodos disponibles independientemente que sean m‡s o menos cl‡sicos o que estŽn basados en tŽcnicas m‡s novedosas como las relacionadas con la quimioinform‡tica. En este sentido, la caracterizaci—n de la secuencia del genoma del Tripanosoma cruzi en 2005 y el correspondiente an‡lisis prote—mico, ha puesto al descubierto nuevas rutas biosintŽticas y prote’nas relevantes para la supervivencia del par‡sito y ha abierto nuevas l’neas de investigaci—n. En este sentido, en el desarrollo de nuevos f‡rmacos aplicando mŽtodos quimioinform‡ticos hay que resaltar entre otros, los que se refieren a los inhibidores de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, de la cruzipa’na y de la sintetasa de la farnesil-pirofosfato o hexoquinasa.

Con todos los recursos cient’ficos disponibles, el descubrimiento de nuevos cabezas de serie (lead compound) y de nuevos f‡rmacos deber’a de ser un proceso m‡s r‡pido, econ—mico, eficiente y sostenible.

4. AGRADECIMIENTOS

Los autores quieren agradecer al Ministerio de Ciencia e Innovaci—n (proyecto TRA2009_0085, 2010-2011), al CSIC (proyecto de cooperaci—n 2009UY01) y a la red CYTED (http://ridimedchag.fq.edu.uy; RIDIMEDCHAG) la ayuda recibida.

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