article

Enzymatic synthesis of fructooligosaccharides that stimulate the gut microbiota

Title in Spanish: S’ntesis enzim‡tica de fructooligosac‡ridos estimuladores de la microbiolog’a col—nica

Paloma Santos-Moriano1* Luc’a Fern‡ndez-Arrojo1 B‡rbara Rodr’guez-Colinas1 Antonio Ballesteros1 Francisco J. Plou1

1Instituto de Cat‡lisis y Petroleoqu’mica CSIC 28049 Madrid Spain

*Corresponding Author: paloma.santos@csic.es     An Real Acad Farm Vol. 81 N¼ 1 (2015) pp. 48-62

Received:  February 3 2015  Accepted: February 27 2015      Language of Manuscript: Spanish

 



1. INTRODUCCIîN

La microflora o microbiota intestinal se define como un complejo ecosistema din‡mico de especies microbianas residentes en el intestino humano el cual es colonizado por un gran nœmero de bacterias. Como puede observarse en la Figura 1 estos microorganismos van aumentando su concentraci—n desde la boca hasta el recto siendo m‡xima en el colon con aproximadamente 1012 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por gramo de contenido intestinal. El colon est‡ habitado por unas cuatrocientas especies bacterianas (1) y se divide en colon ascendente o proximal colon transversal colon descendente o distal y colon sigmoidal. Las bacterias presentes tienen actividades fluctuantes en funci—n de la disponibilidad de sustrato pH potencial redox y distribuci—n en el colon (2). As’ los microorganismos residentes en el colon proximal tienen un suministro abundante de nutrientes provenientes de la dieta de modo que crecen muy r‡pido causando una disminuci—n del pH. Sin embargo en el colon distal la disponibilidad de sustrato es menor las bacterias crecen m‡s lentamente y el pH se acerca a la neutralidad (3).


Figura 1. Esquema de los microorganismos caracter’sticos de las distintas secciones del tracto gastrointestinal (adaptado de Mayo y Delgado 2003 (4)) y de las regiones del colon humano con sus correspondientes actividades bacterianas y diferencias fisiol—gicas (adaptado de Macfarlane 2008 (5)).


Las funciones metab—licas de la microbiota intestinal consisten en la fermentaci—n de sustratos dietŽticos no digeribles. En concreto la fermentaci—n de los hidratos de carbono es una importante fuente de energ’a para la proliferaci—n bacteriana en el colon y produce ‡cidos grasos de cadena corta (AGCC). Mediante esta acidificaci—n se favorece la absorci—n de minerales como Fe Mg y Ca. La actividad metab—lica tambiŽn incluye la producci—n de algunas vitaminas tales como vitamina K B12 biotina ‡cido f—lico ‡cido pantotŽnico y la s’ntesis de amino‡cidos a partir de amoniaco o de urea (6).  Son muchos los factores que pueden influir sobre los niveles de estas poblaciones microbianas alterando el equilibrio bacteriano de la flora intestinal tales como la dieta el estrŽs malos h‡bitos administraci—n de antibi—ticos etc(7). Recientemente en un estudio llevado a cabo con 22 individuos clasificaron 3 enterotipos humanos caracterizados por su microbiota intestinal: enterotipo 1 donde predominan Bacteroides; enterotipo 2 dominando la especie Prevotella; y enterotipo 3 con mayor proporci—n de Ruminococcus. Estos enterotipos parecen venir determinados fundamentalmente por la dieta a largo plazo (8). Lo fundamental es mantener un equilibrio entre las distintas especies bacterianas evitando la excesiva proliferaci—n de aquellas potencialmente pat—genas y obtener as’ una microflora intestinal sana (9). Este equilibrio se puede restablecer mediante la ingesta de alimentos funcionales o bien microorganismos vivos probi—ticos o bien mediante el consumo de oligosac‡ridos prebi—ticos.

Los prebi—ticos son ingredientes que son selectivamente fermentados por la microflora intestinal provocando cambios espec’ficos tanto en su composici—n como en su actividad aportando efectos beneficiosos sobre la salud humana (10). Su consumo produce un aumento en la proporci—n de bacterias beneficiosas como Lactobacillus y Bifidobacterium frente a otras especies mostrando una mejora en la salud del individuo (11). Conviene diferenciarlos de los probi—ticos que se definen como organismos ex—genos vivos que resisten a la digesti—n normal alcanzando el colon e influyendo as’ de manera positiva en la composici—n de la microflora intestinal (1). Los simbi—ticos resultan de la combinaci—n de probi—ticos y prebi—ticos en un mismo producto para mejorar la supervivencia e implantaci—n de los microrganismos en el tracto gastrointestinal.  Los principales efectos benificiosos de los prebi—ticos se deben a la presencia de una flora predominantemente bifidogŽnica. Estos efectos se pueden dividir en tres: la acci—n inmunoprotectora la acci—n metab—lica por la producci—n de AGCC y la acci—n nutricional ya que las bifidobacterias favorecen la s’ntesis de algunas vitaminas como B6 B12 etc. y ayudan a la absorci—n de Ca Mg Fe y Zn. Adem‡s los prebi—ticos son bajos en calor’as y anticariogŽnicos

Los prebi—ticos tienen una serie de ventajas frente a los probi—ticos: estimulan a toda la microbiota no s—lo a una cepa; son m‡s estables y se  pueden a–adir como aditivos a una gama m‡s amplia de productos; y es m‡s f‡cil que lleguen intactos al colon que las bacterias que tienen que sobrevivir al tracto digestivo.

En la Tabla 1 se detallan los carbohidratos aceptados como prebi—ticos hasta el momento. Los fructanos tipo inulina se encuentran en numerosas especies vegetales la oligofructosa se obtiene de la hidr—lisis parcial de la inulina los FOS y GOS a partir de la s’ntesis enzim‡tica de sacarosa y lactosa respectivamente y la lactulosa se obtiene industrialmente por isomerizaci—n de la lactosa.

Los FOS son oligosac‡ridos de D-fructosa (F) con una D-glucosa (G) terminal en los que los grupos fructosilo se unen mediante enlaces glicos’dicos β(2→1) formando la serie 1F-FOS. Cuando la uni—n se realiza mediante enlaces β(2→6) se denomina serie 6F-FOS si se trata de una fructosa y 6G-FOS cuando la uni—n tiene lugar con la glucosa (12) represent‡ndose algunas de estas estructuras en la Figura 2.


Tabla 1. Clasificaci—n de carbohidratos aceptados como prebi—ticos (10).

Prebi—tico

Grado de polimerizaci—n

Nombre comercial

Producci—n (Tm/a–o)

Enzima utilizada

Inulina

(Fru)n-Glc

n = 2-60

Raftiline

> 20 000

Extracci—n directa

FOS

Oligofructosa

(Fru)n-Glc

n = 2-9

Actilight

Raftilosa

12 000

Fructosiltransferasa

Inulinasa

GOS

(Gal)n-Glc

n = 2-5

Oligomate 50

15 000

β-galactosidasas

Lactulosa

Gal-Glc

-

MLS-50

20 000

Catalizador b‡sico


La obtenci—n de FOS se lleva a cabo mediante la s’ntesis enzim‡tica a partir de sacarosa. Las enzimas m‡s empleadas para la obtenci—n industrial de FOS son las fructosiltransferasas m‡s concretamente las sacarosa fructosiltransferasas (EC 2.4.1.99) y las β-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26). La reacci—n de transfructosilaci—n mediada por estas enzimas tiene lugar en dos pasos (13) form‡ndose un intermedio fructosil-enzima por uni—n covalente de una molŽcula de fructosa al centro activo de la enzima y liber‡ndose una molŽcula de glucosa. En el segundo paso se produce un ataque nucleof’lico por un carbohidrato que actœa como molŽcula aceptora del fructosilo dando lugar a la s’ntesis del FOS correspondiente. En caso de que el nucle—filo sea una molŽcula de agua se forma la fructosa. La preferencia por una molŽcula de agua o de carbohidrato como molŽcula aceptora viene determinada por la tasa transferencia/ hidr—lisis de la enzima. As’ se buscan enzimas con elevada tasa de transferencia/ hidr—lisis.

La mayor’a de los FOS que se encuentran en el mercado son de tipo inulina tal como se observa en la Tabla 2 recomend‡ndose un consumo diario de 10 g/ d’a (14).

Las levansacarasas (EC. 2.4.1.10) son enzimas que pertenecen a la familia de las hexosiltransferasas y que se encuentran en microorganismos como Bacillus subtilis Zymomonas mobilis Microbacterium laevaniformans o Bacillus licheniformis(15-17). TambiŽn son conocidas como β-26-fructosiltransferasas porque catalizan la formaci—n de levano un homopol’mero de fructosa con enlaces β(2→6) con alguna ramificaci—n β(2→1) (Figura 3) (18). El levano tiene aplicaciones en la industria alimentaria farmacŽutica y cosmŽtica adem‡s de ser un buen agente antitumoral debido a sus propiedades f’sicas (19). Aparte de la formaci—n del levano las levansacarasas (LEV) producen FOS como se muestra en la Figura 3.

Los FOS producidos por LEV son el producto de la transfructosilaci—n de un grupo fructosilo a una molŽcula de sacarosa o a otro FOS respondiendo a la f—rmula  GFn con n de 1 a 10. El tipo de enlace glicos’lico que se forma entre las fructosas es principalmente del tipo  β(2→6) produciendo entonces 6-kestosa y otros FOS de la misma familia (Figura 3). Sin embargo tambiŽn se ha descrito la formaci—n de otros FOS como la 1-kestosa y el resto de FOS de tipo inulina neokestosa blastosa etc. (Figura 3) por parte de algunas levansacarasas incluyendo la de Z. mobilis(20). Algunas levansacarasas tambiŽn presentan actividad hidrol’tica sobe el levano produciendo molŽculas de fructosa levanbiosa sacarosa olig—meros del levano o levano de bajo peso molecular (21).

La inmovilizaci—n de las enzimas productoras de FOS es deseable debido a la creciente demanda de este tipo de productos por la industria y los consumidores. La inmovilizaci—n de enzimas presenta una serie de ventajas frente a la utilizaci—n de enzimas solubles: aumenta la estabilidad de la enzima favorece la recuperaci—n del producto y disminuye el coste total del proceso ya que el biocatalizador se puede reutilizar. Hay diferentes maneras de inmovilizar enzimas: por atrapamiento por adsorci—n en superficies por enlaces covalentes a un soporte o por enlaces covalentes entre ellas mismas para formar agregados.

La inmovilizaci—n por enlaces covalentes es m‡s estable y reproducible que la inmovilizaci—n por adsorci—n o atrapamiento. Sin embargo presenta la desventaja de que puede afectar a la estructura de la enzima al interaccionar con el soporte. Adem‡s muchas veces los tipos de enlaces que se forman requieren condiciones de reacci—n que no son favorables para la enzima. Por ejemplo para la formaci—n de enlaces de tipo base de Schifft entre un aldeh’do de un soporte y un grupo amino de una enzima se requiere que el pH de la reacci—n sea de 10. A ese pH muchas enzimas pierden irreversiblemente su actividad.



Figura 2. Estructura de los fructooligosac‡ridos. A Serie de 1F-FOS con enlaces b(1→2) entre fructosas. B. Serie de 6F-FOS con enlaces b(2→6) entre fructosas. C. Serie de 6G-FOS con enlaces b(2→6) entre fructosa y glucosa.



Tabla 2. Prebi—ticos con estructura tipo inulina comercializados actualmente.

Prebi—tico

Nombre comercial

Empresa

MŽtodo de obtenci—n

 

Raftilineñ

Beneo Orafti (BŽlgica)

Extracci—n a partir de achicoria

Inulina

Frutafitñ

Sensus (Holanda)

 

Fibrulineñ

Cosucra (BŽlgica)

 

Raftiloseñ

Beneo Orafti

Hidr—lisis parcial de inulina

Oligofructosa

Fructaloseñ

Sensus

 

Fibrulose ñ

Cosucra

FOS

Actilightñ

Beghin Meiji (Jap—n)

Tereos (Francia)

S’ntesis enzim‡tica a partir de sacarosa



Figura 3. Reacciones catalizadas por las levansacarasas.


Ya que las principales industrias consumidoras de FOS son la alimentaria y la farmacŽutica las tŽcnicas por las que se producen los FOS tienen que ser adecuadas para el consumo humano evitando el uso de disolventes org‡nicos o de sustancias t—xicas. La inmovilizaci—n por atrapamiento en geles de alginato c‡lcico ha sido reconocida como apta para el consumo humano (GRAS Generaly Recognized as Safe) y se usa ampliamente en la conocida como gastronom’a molecular. Sin embargo una de las desventajas de esta tŽcnica es que si la enzima no es lo suficientemente grande puede lixiviar de las esferas de alginato. La levansacarasa de Z. mobilistiene una propiedad descrita por Goldman et al.(22) por la cual a valores de pH por debajo de 5.0 forma microfibras que aumentan su peso molecular pudiendo evitar as’ su lixiviaci—n. Otra estrategia para aumentar el tama–o de las prote’nas es entrecruzarlas con glutaraldeh’do o m‡s recientemente con transglutaminasas (TG). Las TGs son enzimas (EC 2.3.2.13) que catalizan la formaci—n de enlaces covalentes entre grupos amino libres y el grupo γ-carboxiamida de las prote’nas o de una glutamina de una prote’na. Los productos entrecruzados normalmente con alto peso molecular son muy resistentes al esfuerzo mec‡nico y a la degradaci—n proteol’tica (23). Las TGs ya se han usado para inmovilizar enzimas pero principalmente para unir covalentemente las enzimas a una matriz (24). Las TGs tambiŽn son GRAS y se utilizan en la industria alimentaria para el procesamiento de carne pescado y l‡cteos.

Los objetivos de este trabajo fueron caracterizar la enzima levansacarasa de Zymomonas mobilis estudiar la s’ntesis enzim‡tica de fructooligosac‡ridos catalizada por dicha enzima y optimizar la reacci—n para su uso en la industria mediante estrategias de inmovilizaci—n.

2. MATERIALES Y MƒTODOS

2.1. Enzimas y reactivos

La enzima levansacarasa de Zymomonas mobilis se adquiri— como un preparado comercial de extracto extracelular en polvo de Amano (Jap—n). Los azœcares sacarosa glucosa fructosa 1-kestosa y nistosa eran de Sigma. La 6-kestosa la neokestosa y la blastosa fueron aisladas e identificadas previamente en el laboratorio. La transglutaminasa se compr— a la empresa japonesa Ajinomoto con el nombre comercial de Activa WM. El alginato s—dico (Protanal LF 120 LS) se adquiri— de FMC BioPolymer (USA). Todos los reactivos eran de la m‡xima pureza disponible en el mercado.

2.2. Caracterizaci—n de la enzima

La actividad catal’tica de la preparaci—n enzim‡tica se determin— con el mŽtodo del ‡cido 35-dinitrosalic’lico (DNS) para azœcares reductores descrito por Miller (25) con sacarosa 100 g/l como sustrato. La actividad (U/mg) se defini— como los mmol de azœcares reductores producidos en 1 minuto por miligramo de biocatalizador s—lido comercial. La concentraci—n de prote’na total se determin— mediante el mŽtodo de Bradford (26) con el reactivo de Bio-Rad. El peso molecular de la prote’na se estim— analizando la preparaci—n enzim‡tica en un gel de poliacrilamida 10% con SDS te–ido con Protoblueª Safe (National Diagnosis) y comparando el tama–o de la banda principal con marcadores de peso molecular de prote’nas (Novagen). La transferencia a una membrana de PVDF (Bio-Rad) se realiz— con el Trans-Blot¨ Turboª Transfer System (Bio-Rad). La membrana se ti–— con Coomassie y las bandas de interŽs se cortaron y se enviaron a un laboratorio externo para los an‡lisis de secuenciaci—n del dominio N-terminal.

Se calcularon las condiciones —ptimas de pH y temperatura en tŽrminos de actividad y estabilidad. Para la estabilidad frente al pH se prepararon las siguientes soluciones tamp—n: acetato s—dico 50 mM a  pH 3.0 3.6 4.0 4.4 y 5.0; y fosfato s—dico 50 mM a pH 5.0 6.0 7.0 y 8.0. La enzima se incub— durante 24 h a 35¼C en cada uno de los tampones y se midi— la actividad residual con el mŽtodo del DNS. Para el pH —ptimo la actividad en sacarosa 100 g/l (1 ml) se midi— a 35¼C durante 20 min en los tampones descritos previamente. Posteriormente se midi— la actividad por el mŽtodo del DNS. Para medir la estabilidad frente a la temperatura la enzima se incub— durante 1 h a diferentes temperaturas entre 4-75¼C y a pH 5.0 y la actividad residual se midi— por el mŽtodo del DNS. Para determinar la temperatura optima se incubaron reacciones de 1 ml con sacarosa 100 g/l a diferentes temperaturas (25-75¼C) y pH 5.0. La actividad de cada una de las reacciones se midi— por el mŽtodo del DNS.

2.3. Identificaci—n y cuantificaci—n de los productos de reacci—n

La identificaci—n de los productos de la reacci—n de la levansacarasa con sacarosa como sustrato se llev— a cabo mediante cromatograf’a de intercambio ani—nico con un detector amperomŽtrico de pulsos (HPAEC-PAD). Los oligosac‡ridos se analizaron empleando la columna CarboPack PA1 y los oligosac‡ridos y polisac‡ridos con la CarboPack PA200. Cinco unidades de levansacarasa (soluble o inmovilizada) por ml de reacci—n se a–adieron a una soluci—n de sacarosa 600 g/l en tamp—n acetato s—dico 50 mM  pH 5.6 y se incub— a 40¼C con agitaci—n suave. Se tomaron muestras a diferentes tiempos que fueron inactivadas con Na2CO3 0.4 M filtradas en tubos de centr’fuga con filtros de celulosa (0.45 mm National Scientific) y diluidas con agua antes de ser inyectadas en el equipo cromatogr‡fico. Las fases m—viles utilizadas para cada columna se muestran en la Tabla 3. S—lo fue posible la cuantificaci—n de aquellos productos de los que se dispon’a del est‡ndar correspondiente para realizar una curva de calibrado. La concentraci—n de los productos desconocidos se estim— como la diferencia entre la cantidad inicial de sacarosa y la suma de los productos conocidos. La actividad hidrol’tica se determin— a partir de la cantidad de fructosa libre. La actividad de transfructosilaci—n se calcul— con la diferencia entre las cantidades de glucosa y fructosa libres. La tasa de transfructosilaci—n/ hidr—lisis se defini— como el cociente entre ambas actividades.

Algunos de los productos de reacci—n desconocidos se purificaron mediante HPLC semipreparativa con una bomba Delta 600 (Waters) y un detector de ’ndice de refracci—n (Varian). La columna semipreparativa era una Kromasil NH2mm (250 x 10 mm) y la fase m—vil era acetonitrilo:agua 68:32 (v/v). Los productos aislados se enviaron a un laboratorio externo para los an‡lisis de espectrometr’a de masas y resonancia magnŽtica nuclear (RMN).

 2.4. Entrecruzamiento de la enzima con transglutaminasa (TG)

Para el entrecruzamiento de LEV se a–adieron diferentes cantidades de transglutaminasa (100 U/g) a una soluci—n de LEV y se incubaron durante 1 h a 35¼C con agitaci—n suave. Los productos del entrecruzamiento se visualizaron electroforŽticamente en condiciones nativas y desnaturalizantes. La presencia de actividad se determin— con el reactivo cloruro de 235-tripheniltetrazolio (TTC) tras una incubaci—n en sacarosa siguiendo el protocolo descrito por Mukasa et al.(27). Las reacciones se dejaron toda la noche a 4¼C para observar la precipitaci—n de conglomerados de alto peso molecular.


Tabla 3. Composici—n de la fase m—vil para HPAEC-PAD. A NaOH 200 mM; B agua; C acetato s—dico (AcONa) 200 mM; D AcONa 320 mM en NaOH 100 mM.

CarboPack PA1

CarboPack PA200

t (min)

A (%)

B (%)

C (%)

Concentraci—n

t (min)

A (%)

B (%)

D (%)

Concentraci—n

0

10

90

0

20 mM NaOH

0

50

50

0

100 mM NaOH

13

10

90

0

20 mM NaOH

15

25

25

50

100 mM NaOH +

160 mM AcONa

20

50

30

20

100 mM NaOH +

 40 mM AcONa

50

0

0

100

100 mM NaOH +

320 mM AcONa

30

50

30

20

100 mM NaOH +

40 mM AcONa

85

0

0

100

100 mM NaOH +

 320 mM AcONa

35

50

0

50

100 mM NaOH +

100 mM AcONa

86

50

50

0

100 mM NaOH

37

50

0

50

100 mM NaOH +

100 mM AcONa

95

50

50

0

100 mM NaOH

40

10

90

0

20 mM NaOH

         

50

10

90

0

20 mM NaOH

         

2.5. Inmovilizaci—n

La enzima se inmoviliz— por atrapamiento en alginato c‡lcico goteando una disoluci—n 1:1 de enzima:alginato s—dico 4% (p/v) sobre una disoluci—n de CaCl2 200 mM. Este protocolo se sigui— para la inmovilizaci—n de LEV a pH 4.0 a pH 5.6 y de LEV tras el entrecruzamiento con TG. El rendimiento de la inmovilizaci—n se calcul— midiendo la actividad y la cantidad de prote’na presente en las distintas soluciones de inmovilizaci—n y compar‡ndolo con los datos de la soluci—n enzim‡tica inicial. Se utilizaron diferentes concentraciones iniciales de LEV y se determin— que la concentraci—n m‡s eficiente era 100 mg/ml de preparaci—n enzim‡tica ya que algo de la actividad se perd’a con la incubaci—n con TG. 

Las esferas de alginato se deshidrataron mediante aireaci—n forzada para formar ÒDALGEEsÓ (Dry ALGinate Entrapped Enzymes) (28) y se estudi— su actividad y su estabilidad. El ensayo de lixiviaci—n consisti— en ciclos secuenciales de reacciones en batch y de lavados con sacarosa: los DALGEEs se incubaron con  500 ml de sacarosa 600 g/l en las condiciones —ptimas de reacci—n durante 20 min a 40¼C y 600 rpm durante cada ciclo de reacci—n. El medio de reacci—n se extrajo para analizar su actividad residual mediante el mŽtodo del DNS y los biocatalizadores se lavaron dos veces con sacarosa fr’a antes de comenzar otro ciclo.

2.6. Visualizaci—n de los biocatalizadores con microscop’a electr—nica de barrido (SEM)

La visualizaci—n fue posible con la ayuda del Laboratorio de TŽcnicas No Destructivas del Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid (CSIC). Las esferas de alginato se observaron con el FEI INSPECT un SEM que puede trabajar a bajo vac’o (0.08 a 0.60 torr) y que dispone de un detector de electrones secundarios y otro de backscaterring. Tanto las esferas de alginato como los DALGEEs se analizaron con el FEI QUANTA 200 un SEM que puede operar a tres modos de vac’o: alto vac’o bajo vac’o (0.08 a 1 torr)  y a condiciones ambientales o ESEM (1 a 20 torr) con un detector de electrones secundarios y otro de backscattering. Las esferas de alginato se analizaron en condiciones ambientales y los DALGEEs a bajo vac’o porque la resoluci—n era mejor. Este microscopio estaba acoplado a un detector de masas que funcionaba al trabajar a bajo vac’o y que pod’a analizar f‡cilmente cualquier porci—n de la muestra.

3. RESULTADOS

3.1. Actividad catal’tica y condiciones —ptimas de la enzima soluble

Se estudi— el efecto de la temperatura en la actividad y estabilidad de la enzima soluble (Figura 4). Aunque observando las gr‡ficas se puede comprobar que la temperatura —ptima de LEV era 54¼C la enzima no era estable a temperaturas superiores a 44¼C (Figura 4A). En cuanto al pH el valor —ptimo y el de m‡xima estabilidad era el mismo pH 5.6 (Figura 4B). Por lo tanto las condiciones seleccionadas para operar con la enzima soluble se fijaron en 40¼C y pH 5.6. Bajo estas condiciones la actividad catal’tica de enzima era 6.68 U por mg de preparado comercial. La preparaci—n enzim‡tica ten’a un contenido en prote’na del 6.25% (p/p).

El peso molecular de la levansacarasa suponiendo que Žsta es la banda mayoritaria era aproximadamente de 45 kDa segœn SDS-PAGE (Figura 5A flecha roja). Aparte de la banda mayoritaria se pod’an observar otras prote’nas contaminantes en la preparaci—n enzim‡tica. Para dilucidar cu‡l de las bandas ten’a actividad se hizo un zimograma y se encontraron tres bandas capaces de producir azœcares reductores (Figura 5B carril 1). Un gel en condiciones nativas se transfiri— a una membrana de PVDF se recortaron las bandas de interŽs y se enviaron a un laboratorio externo (Microbial Interactions and Processes Research Group HZI Alemania) para la secuenciaci—n de su dominio N-terminal. Los resultados mostraron que las tres bandas correspond’an a secuencias de levansacarasa por lo que se deduce que pueden ser isoformas de la misma. Con esto se concluye que toda la actividad que presenta la preparaci—n enzim‡tica de Amano¨ se puede atribuir a la enzima levansacarasa de Z. mobilis.


Figura 4. Temperatura y pH —ptimos. A. Estabilidad (c’rculos negros) expresada como actividad residual tras 24 h de incubaci—n y temperatura —ptima (c’rculos blancos) en U/mg de preparado comercial. B. Estabilidad (c’rculos negros) expresada como actividad residual tras 1 h de reacci—n y pH —ptimo (c’rculos blancos) en U/mg de preparado comercial.



 

Figura 5. SDS-PAGE y actividad en gel (zimograma). A. SDS-PAGE. Carril 1: marcadores de peso molecular. Carril 2: LEV. Carril 3: TG. Carril 4: LEV + 10 U/ml TG. Carril 5: LEV + 20 U/ml TG. Carril 6: LEV + 40 U/ml TG. B. Zimograma. Carril 1: LEV. Carril 2: LEV + 10 U/ml TG. Carril 3: LEV + 20 U/ml TG. Carril 4: LEV + 40 U/ml TG.


3.2. Producci—n de fructooligosac‡ridos por la levansacarasa soluble

Se analiz— una reacci—n con sacarosa 600 g/l y 5 U/ml de LEV soluble en tamp—n acetato 50 mM pH 5.6. Con la ayuda de est‡ndares se identificaron los oligosac‡ridos 1-kestosa 6-kestosa blastosa neokestosa y nistosa mediante HPAEC-PAD con la columna CarboPack PA1 (Figura 6A). Se formaban tambiŽn otros productos para los que no dispon’amos de est‡ndares. El pico 13 se purific— por HPLC semipreparativa y se envi— a un servicio externo para la identificaci—n por masas y RMN. Los resultados de espectrometr’a de masas mostraron que el pico 13 era un tetrasac‡rido (MW = 666 g/mol). Finalmente los resultados de RMN confirmaron que se trataba de la 66-nistosa.


Figura 6. Cromatograma de los FOS producidos por LEV soluble. Condiciones de reacci—n: 5 U/ml de LEV soluble y 600 g/l de sacarosa en tamp—n acetato s—dico 50 mM pH 5.6 A. HPAEC-PAD con columna CarboPack PA1 19 h de reacci—n. B. HPAEC-PAD con columna CarboPack PA200 50 h de reacci—n. L’nea gris: est‡ndar de inulina.  1: glucosa; 2: fructosa; 3: sacarosa; 5: 1-kestosa; 6: blastosa; 8: 6-kestosa; 10: neokestosa; 12: nistosa; 13: 66-nistosa.


La producci—n de FOS por la enzima soluble alcanz— su m‡ximo cuando el 85% de la sacarosa se hab’a consumido y la tasa de transfructosilaci—n/hidr—lisis era 2.2. El FOS m‡s abundante en la reacci—n era 6-kestosa seguido de 1-kestosa y neokestosa (Figura 7 tri‡ngulos). Adem‡s el pico de blastosa era bastante importante en la reacci—n pero no dispon’amos de cantidad suficiente para cuantificarlo.

Aparte de estos FOS se puede observar en los cromatogramas que la enzima es capaz de formar otros oligosac‡ridos de mayor grado de polimerizaci—n que no se pueden identificar. Dado que uno de los productos descritos para la levansacarasa es el levano se intentaron visualizar oligosac‡ridos cada vez m‡s largos. Para ello se utiliz— HPAEC-PAD con la columna CarboPack PA200.

Como est‡ndar para aproximar el grado de polimerizaci—n se utiliz— inulina (Raftiline¨ Orafti) (Figura 6B cromatograma gris) donde se puede observar toda la serie de la inulina desde GF2 hasta GF60. Las mismas muestras recogidas para el an‡lisis de los FOS se analizaron con la nueva columna (Figura 6B). Al ser una columna m‡s resolutiva adem‡s de los FOS identificados en el experimento anterior tambiŽn se pudieron identificar la difructosa (F2) fructosilnistosa (GF4) y la neonistosa; adem‡s de diversos productos de la serie de la inulina (GFn y Fn). En la Figura 6B se puede observar c—mo van apareciendo picos de azœcares cada vez m‡s largos tanto de la serie de la inulina (1F-FOS) como otros sin identificar que probablemente pertenezcan la serie 6F-FOS. Sin embargo el levano de peso molecular mucho m‡s elevado no se pudo visualizar con este tipo de cromatograf’a.

3.3. Entrecruzamiento de la levansacarasa con transglutaminasa

Debido al reducido tama–o de LEV para su inmovilizaci—n por atrapamiento la enzima se entrecruz— usando la enzima transglutaminasa. Se probaron diferentes proporciones de ambas enzimas y LEV conservaba altos niveles de actividad (medida por DNS) incluso tras la adici—n de grandes cantidades de TG (resultados no incluidos). Para analizar el tama–o de los agregados las reacciones se estudiaron electroforŽticamente. Aparecieron las mismas bandas que en el carril de LEV pero adem‡s se pod’a ver un conglomerado que no era capaz de penetrar en el gel (Figura 5A flecha negra). Para comprobar si esa banda era activa se estudi— la actividad con un zimograma (Figura 5B carriles 2 3 y 4 flecha negra). La banda del agregado formado por entrecruzamiento era una vez m‡s incapaz de entrar en el gel pero se pudo detectar actividad. Sin embargo una cantidad importante de LEV quedaba sin entrecruzar incluso tras el tratamiento con 40 U/ml de TG. TambiŽn se pudo observar la precipitaci—n de prote’nas de alto peso molecular cuando los eppendorfs con las reacciones se dejaban por la noche en el frigor’fico (Figura 8A).


Figura 7. Comparaci—n de la s’ntesis de FOS por LEV soluble (tri‡ngulos) LEV inmovilizada (c’rculos negros) y LEV inmovilizada previamente entrecruzada con TG (c’rculos blancos). A. 1-kestosa. B. 6-kestosa. C. Neokestosa. D. Nistosa.



3.4. Cambio de la estructura cuaternaria de LEV con el pH

Segœn Goldman y cols.(22) la levansacarasa de Z. mobilis existe en dos formas dependiendo del pH. A valores de pH por debajo de 5.0 forma microfibras que aumentan su tama–o mientras que a pH por encima de 5.0 la enzima se encuentra principalmente en forma de d’mero soluble. Para observar este efecto se incub— LEV en tampones a diferentes pH y se dejaron toda la noche. Se observaron precipitados a pH 4.0 y en menor medida a pH 5.0 (Figura 8B) aunque en ambos casos significativamente menos que tras el entrecruzamiento con TG. TambiŽn se incub— LEV sola en las mismas condiciones para comparar los resultados.

Figura 8. Precipitaci—n de agregados de alto peso molecular. A. Precipitaci—n tras el entrecruzamiento con TG. 1: LEV 20 mg/ml. 2 3 y 4: LEV 20 mg/ml tras 1 h de reacci—n con 1 5 y 10 U/ml de TG respectivamente. 5 6 y 7: LEV 20 mg/ml tras 2 h de reacci—n con 10 20 y 40 U/ml de TG respectivamente. B. Precipitaci—n de microfibras de LEV formadas a bajo pH. 1 2 y 3: LEV 20 mg/ml en tamp—n acetato pH 4.0 5.0 y 6.0 respectivamente. 4 5 y 6: LEV 20 mg/ml en tamp—n fosfato pH 6.0 7.0 y 8.0 respectivamente.

3.5. Inmovilizaci—n

La enzima LEV se inmoviliz— siguiendo las dos estrategias descritas para aumentar su tama–o: entrecruzamiento con TG y ajustando el pH por debajo de 5.0. La enzima tambiŽn se inmoviliz— en su forma soluble a pH 5.6 para comparar los resultados. Primero se inmovilizaron por atrapamiento para formar esferas de alginato (Figura 11E izq.). Aunque el rendimiento de la inmovilizaci—n fue superior al 90% (Tabla 4) estas esferas demostraron no mostraron una gran estabilidad operacional en batch; las tres estrategias perd’an la enzima durante los primeros 4 ciclos de reacci—n  (Figura 9A).  Para intentar evitar el problema de la lixiviaci—n  las esferas de  alginato se secaron para formar DALGEEs (Dry ALGinate Entrapped Enzymes) (Figura 11E dcha.). Esta estrategia result— ser m‡s eficaz. El tama–o de los DALGEEs es aproximadamente un tercio de las bolas de alginato (Figura 11). Los mejores resultados de actividad frente a lixiviaci—n se obtuvieron con la estrategia de la TG. Tras 15 ciclos de reacci—n el biocatalizador conservaba el 85% de su actividad inicial (Figura 9B) es decir aproximadamente 18 U por gramo de biocatalizador. El aumento de actividad tras el primer ciclo de reacci—n se puede explicar por la hidrataci—n de los DALGEEs al entrar en contacto con el medio l’quido de la reacci—n y por lo tanto la ligera relajaci—n de la red de alginato que facilita el intercambio entre sustratos y productos. Los DALGEEs a pH 4.0 ten’an m‡s actividad al principio pero al estudiar la lixiviaci—n con sacarosa 600 g/l a pH 4.0 la sacarosa daba se–al en el ensayo de DNS probablemente como consecuencia de una hidr—lisis ‡cida haciendo imposible el an‡lisis de los datos (resultados no incluidos).


Tabla 4. Rendimiento de la inmovilizaci—n de LEV en alginato c‡lcico. La actividad se midi— en dos puntos durante la inmovilizaci—n: tras la incubaci—n con TG y tras la inmovilizaci—n.

         Rendimiento de incubaci—n *

Rendimiento de inmovilizaci—n

Rendimiento total

LEV

58%

94%

55%

LEV + TG

59 %

92%

54%

*   Tras 2 h de incubaci—n con TG a 35¼C pH 5.6 600 rpm


 

Figura 9. Estabilidad operacional de los biocatalizadores de alginato. A. Actividad residual de las bolas de alginato de LEV inmovilizada a pH 4.0 a pH 5.6 y LEV inmovilizada previamente entrecruzada con TG a pH 5.6 tras varios ciclos de reacci—n con sacarosa 600 g/l. B. Actividad residual de los DALGEEs de LEV a pH 5.6 y LEV + TG tras varios ciclos de reacci—n con sacarosa 600 g/l.


3.5. Producci—n de fructooligosac‡ridos por la levansacarasa inmovilizada

Una vez que la enzima estuvo inmovilizada se estudiaron reacciones en las mismas condiciones que con la enzima soluble y las muestras se analizaron por HPAEC-PAD. B‡sicamente se formaron los mismos productos que con la enzima soluble solo que en distinta proporci—n (Figura 7 c’rculos negros y blancos). Adem‡s las reacciones con biocatalizadores inmovilizados parec’an ir m‡s r‡pidas a pesar de haber puesto las mismas unidades. Esto pudo ser causado por el efecto observado en el ensayo de lixiviaci—n por el cual la actividad aumentaba tras el primer ciclo de reacci—n.

Aunque inicialmente ambas reacciones (con la enzima soluble e inmovilizada) se estudiaron con el mismo nœmero de unidades de LEV por ml este efecto puede haber causado que la actividad de los DALGEEs fuera en realidad mayor que la que se calcula con un solo ensayo de DNS. Sin embargo lo que parece bastante claro es que la enzima es capaz de consumir casi toda la sacarosa presente en la reacci—n y permanece activa incluso despuŽs de 129 h de reacci—n (datos no mostrados). No hubo diferencias significativas entre los productos formados por LEV inmovilizada sola y LEV previamente entrecruzada con TG aunque se pudo observar un ligero aumento en la producci—n de FOS en la estrategia con TG que ten’an una tasa de transfructosilaci—n/ hidr—lisis de 1.8.

La producci—n de FOS con LEV inmovilizada alcanz— su m‡ximo cuando casi toda la sacarosa se hab’a consumido (Figura 10B) y la tasa de transfructosilaci—n hidr—lisis era de 1.6. Una vez que la conversi—n de sacarosa fue total la concentraci—n de 1-kestosa y neokestosa empez— a caer (Figuras 7A y 7C) mientras que la concentraci—n de 6-kestosa parec’a aumentar (Figura 7B). Esto indica que probablemente LEV est‡ actuando sobre la 1-kestosa produciendo oligosac‡ridos m‡s largos. Estos oligosac‡ridos se pueden observar en los tiempos largos de retenci—n de los cromatogramas (Figura 6) pero como su identidad es desconocida no se puede saber su concentraci—n exacta.


Figura 10. Variaci—n de la concentraci—n de sacarosa glucosa fructosa y suma de FOS conocidos frente al tiempo de reacci—n. Reacci—n con LEV soluble (primer gr‡fico). Reacci—n con LEV inmovilizada (segundo gr‡fico).


3.6. Visualizaci—n de los biocatalizadores mediante microscop’a electr—nica de barrido (SEM)

Las esferas de alginato son muy dif’ciles de observar con microscop’a electr—nica debido a su alto contenido en agua (90%). Las condiciones de alto vac’o dentro de los microscopios hacen que las esferas se deshidraten y se pierda la estructura original de la red de alginato c‡lcico. Sin embargo con las condiciones de bajo vac’o del SEM FEI INSPECT las bolas de alginato se pudieron visualizar cuando hab’an perdido solo un tercio de su volumen (Figura 11A) y se puede apreciar lo que parece que son los poros por los que se podr’a estar produciendo la difusi—n de sustratos y productos. Cuando se intent— observar las bolas de alginato en condiciones ambientales la resoluci—n no era muy buena (no se muestra la imagen).

Los DALGEEs se observaron con en un microscopio SEM FEI QUANTA 200 en condiciones de bajo vac’o (Figura 11 B-D). A pesar de acercarse bastante a la superficie no se pudo detectar ningœn poro. Sin embargo se pueden ver unas franjas paralelas que pueden ser producto de la deshidrataci—n pero tambiŽn nos podr’a estar dando una idea de la estructura interna de la red de alginato. Algunos DALGEEs presentaban cristales de NaCl y de  CaCl2 en la superficie procedentes de los tampones y disoluciones utilizados durante la inmovilizaci—n.


 

Figura 11. Visualizaci—n de las esferas de alginato y los DALGEEs. A. Esfera de alginato visualizada con SEM FEI INSPECT en condiciones de bajo vac’o. Escala: 1 mm. B y C. DALGEEs de LEV visualizados con SEM FEI QUANTA 200 en condiciones de bajo vac’o (30.0 Pa). Escala B: 1.0 mm. Escala C: 50.0 µm. D. Superficie de DALGEE de LEV entrecruzado con TG visualizado con SEM FEI QUANTA 200 en condiciones de bajo vac’o (30.0 Pa). Escala: 10.0 µm. E. Fotograf’a de esferas de alginato (izq.) y DALGEEs (dcha.).


4. DISCUSIîN

Los datos obtenidos en la caracterizaci—n de la levansacarasa de Z. mobilisparecen concordar con estudios previos sobre esta enzima (16, 20, 29, 30).

En cuanto a las tres bandas con actividad reductora de azœcares presentes en el gel de actividad se enviaron a un laboratorio externo para secuenciar su extremo N-terminal y comprobar quŽ clase de enzimas son probablemente las dos m‡s importantes correspondan a las dos levansacarasas de Z. mobilis descritas en su genoma (nœmeros de acceso en GeneBank AAV88999.2  y AAV88998.1 (31)

En cuanto a la producci—n de FOS se encontr— cierta discordancia entre los resultados publicados previamente y nuestros resultados. Adem‡s nunca antes se hab’a hecho un estudio cromatogr‡fico en detalle. Mientras que en la bibliograf’a la 6-kestosa est‡ definida como el principal producto de LEV (20) encontramos que esto era verdad solo durante las primeras horas de reacci—n usando la enzima soluble. Por el contrario con la enzima inmovilizada el principal producto era la 1-kestosa.

TambiŽn hubo diferencias en las cantidades de FOS producidas por la enzima soluble e inmovilizada. La enzima soluble sintetizaba considerablemente m‡s 6-kestosa y neokestosa que la enzima inmovilizada. TambiŽn se produc’a ligeramente m‡s 1-kestosa con la enzima soluble pero no de manera significativa. Por otra parte la nistosa presentaba pr‡cticamente la misma tasa de producci—n en todas las reacciones. Esto significa un cambio de selectividad en la producci—n de trisac‡ridos cuando la enzima se inmoviliza.

En cuanto a la producci—n de azœcares m‡s largos con el uso de la columna CarboPack PA200 se pudo visualizar el crecimiento de los FOS hasta un grado de polimerizaci—n de aproximadamente GF20. Muestras de tiempos m‡s largos no mostraban tantos picos de alto grado de polimerizaci—n. Esto puede ser debido a que todo se ha transformado ya en levano de m‡s peso molecular que no es posible visualizar por cromatograf’a.

Cuando la enzima se inmoviliz— por atrapamiento en alginato c‡lcico se observaba lixiviaci—n incluso cuando LEV hab’a sido entrecruzada con TG. Sin embargo con la estrategia de los DALGEEs previo entrecruzamiento con TG se conservaba un 85% de la actividad tras 15 ciclos de reacci—n. Siempre se obten’a el mismo perfil de actividad en el que el segundo ciclo de reacci—n daba m‡s actividad que el primero. Una posible explicaci—n a este fen—meno es que cuando las esferas se secan y se quedan compactas algunas molŽculas de enzimas no son accesibles para el sustrato. Cuando los DALGEEs se incuban en una disoluci—n de sacarosa en el primer ciclo se rehidratan ligeramente haciendo la red de inmovilizaci—n m‡s flexible y facilitado la difusi—n de sustratos y productos. Es interesante comprobar que los DALGEEs no vuelven a su forma original de esferas de alginato totalmente hidratadas debido a la baja actividad del agua (aw) de la disoluci—n de sacarosa empleada.

5. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos la enzima levansacarasa es muy adecuada para la producci—n a escala industrial de FOS. A diferencia de otras enzimas relacionadas (p.ej. β-fructofuranosidasas) la levansacarasa produce una mezcla compleja de productos que podr’an tener efectos sinŽrgicos en cuanto a sus propiedades prebi—ticas. La amplia gama de FOS producidos por esta enzima abre posibilidades m‡s all‡ de los FOS de la familia de la inulina en los que est‡n centrados la mayor parte de los productos actualmente comercializados.

De las estrategias de inmovilizaci—n ensayadas la mejor fue el entrecruzamiento con TG siguiendo la mertodolog’a de los DALGEEs aunque una cantidad importante de LEV quedara sin entrecruzar. Esta estrategia no solo no afect— a la actividad de LEV sino que parec’a aumentar ligeramente la producci—n de FOS en comparaci—n con la enzima inmovilizada sin entrecruzar. El cambio en la selectividad puede ser interesante si se requiere la producci—n de un tipo de FOS en particular como por ejemplo la 1-kestosa o la nistosa.

El mŽtodo de inmovilizaci—n propuesto que combina atrapamiento en alginato c‡lcico con entrecruzamiento con tranglutaminasa es muy interesante para la producci—n de FOS y su aplicaci—n a la industria alimentaria debido a que todos los materiales son aptos para el consumo humano. La optimizaci—n de esta tŽcnica supondr’a una f‡cil producci—n de FOS prebi—ticos a partir de un sustrato barato y f‡cilmente accesible como es la sacarosa.

TambiŽn ser’a interesante optimizar la producci—n del polisac‡rido sintetizado por la levansacarasa  (levano) debido a su capacidad antitumoral (19) anticolesterolŽmica antioxidante (32) y antidiabŽtica entre otras. Dichos procesos permitir’an reducir el elevado precio que tiene el levano a d’a de hoy.

6. AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado con proyecto del Ministerio de Ciencia e Innovaci—n (BIO2010-20508-C04-01) y otro del Ministerio de Econom’a y Competitividad (BIO2013-48779-C4-1-R). Agradecemos a Amano (Jap—n) por su amable donaci—n de la enzima levansacarasa.

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