ARTêCULO

Estandarizaci—n de un modelo murino de malaria cerebral en fases cl’nicas para la evaluaci—n de terapias antimal‡ricas y de rescate

Gabriela Mart’nez 1, Mar’a Linares 1,2à, Patricia Mar’n-Garc’a 1,2´, Susana PŽrez-Benavente 1, Antonio Puyet 1,2, JosŽ M. Bautista 1,2 * y Amalia D’ez 1,2

1Departamento de Bioqu’mica y Biolog’a Molecular IV; Universidad Complutense de Madrid; Ciudad Universitaria; 28040 Madrid, Espa–a. 2Instituto de Investigaci—n Hospital 12 de Octubre, Madrid, Espa–a. àDirecci—n actual: Diseases of the Developing World, GlaxoSmithKline, 28760 Tres Cantos, Madrid, Espa–a. ´Direcci—n actual: Departamento de Medicina Preventiva y Salud Publica & Inmunolog’a y Microbiolog’a mŽdicas. Universidad Rey Juan Carlos, 28922 Alcorc—n Madrid, Espa–a.

e-mail: jmbau@vet.ucm.es


Premio Real Academia Nacional de Farmacia del Concurso Cient’fico de la Real Academia Nacional de Farmacia 2012. An. Real Acad. Farm. Vol 79, N¼ 2 (2013), pag. 274-292

RESUMEN

Entre las enfermedades infecciosas m‡s devastadoras del SNC se incluye la MC, debido a la alta mortalidad y las graves secuelas que ocasiona. Actualmente, no existe tratamiento farmacol—gico espec’fico, ni de rescate de lesiones neurocognitivas residuales, y su desarrollo est‡ limitado por la inexistencia de modelos experimentales bien definidos. En este trabajo se caracteriz— fenot’picamente la infecci—n en un modelo murino de MC evaluando par‡metros cl’nicos que permitieron establecer cuatro estadios de la enfermedad. Este protocolo proporciona el marco experimental adecuado para estudiar terapias coadyuvantes neuroprotectoras que puedan prevenir y/o eliminar las secuelas neurol—gicas presentes en los individuos que sobreviven.

Palabras clave: Malaria Cerebral; Artesunato; Plasmodium berghei ANKA.

ABSTRACT

Standardization of a cerebral malaria murine model in clinical stages for antimalarial and rescue therapies evaluation

Cerebral malaria (CM) is included among the more devastating SNC infectious diseases due to its high mortality and severe sequelae in children. Currently, no specific pharmacological treatment for CM or rescue therapy for neurocognitive residual injury are available, and research on this topic has been hampered due to the lack of well-defined experimental models. In the present study we have characterized the CM murine infection phenotypically, evaluating clinical parameters, which allowed establishing a model encompassing four distinct disease stages. This protocol provides the experimental framework to study adjunctive neuroprotective therapies that may prevent and/or eliminate the neurological sequelae in individuals surviving CM.

Keywords: Cerebral Malaria; Artesunate; Plasmodium berghei ANKA.

1. introducCIîn

La malaria es la infecci—n parasitaria m‡s importante en el mundo por su elevada tasa de morbilidad, mortalidad e impacto socioecon—mico que ocasiona en la poblaci—n humana (1). Cada a–o se diagnostican alrededor de 200 a 300 millones de nuevos casos de malaria, de los cuales se calcula que aproximadamente 600.000 mueren a consecuencia de la infecci—n y m‡s del 90% de ellos ocurren en çfrica (2).

Los s’ntomas cl’nicos de la enfermedad difieren desde la manifestaci—n œnica de cuadros febriles leves (malaria no complicada) hasta la aparici—n de una malaria severa, que puede llegar a ser letal (3). La mayor’a de los casos de malaria severa, y de las muertes asociadas a ella, se producen debido al paludismo ocasionado por P. falciparum, especie responsable de la forma m‡s grave de malaria humana. La malaria grave es un trastorno multisistŽmico que afecta a varios tejidos y —rganos, aunque sus manifestaciones cl’nicas m‡s marcadas implican generalmente a un solo —rgano, como es el caso del cerebro en la malaria cerebral (4). La malaria cerebral (MC) es una de las complicaciones m‡s frecuentes y serias de todas las que ocurren, cursa con alteraciones neurol—gicas diversas, asoci‡ndose con la aparici—n de delirio y progresi—n al coma que desemboca en la muerte del paciente en un per’odo relativamente corto de tiempo si no se administra atenci—n mŽdica adecuada (3, 5, 6). Incluso con el tratamiento correcto, la tasa de letalidad entre los ni–os con malaria cerebral se aproxima a 20% (7). Esta forma severa con rasgos de encefalopat’a difusa aguda hace de la malaria por P. falciparum la infecci—n parasitaria con mayor importancia del SNC afectando principalmente a ni–os de dos a cinco a–os, mujeres embarazadas y turistas que visitan zonas de alto riesgo, aunque las manifestaciones cl’nicas en ni–os y adultos son distintas (8, 9).

Aunque la malaria cerebral puede llegar a ser fatal en un 15-30% de los casos que la padecen, es potencialmente reversible y generalmente los pacientes que sobreviven a la enfermedad sufren una recuperaci—n completa de las deficiencias f’sicas y neurol—gicas observadas, restableciendo la consciencia tras 2‑3 d’as de tratamiento antimal‡rico (9, 10). Sin embargo, se ha visto que a pesar de la eficacia en la terapia antimal‡rica, algunos individuos que sobreviven a la MC mantienen graves secuelas neurol—gicas a largo plazo (11-13). Dichas secuelas pueden llegar a ser fatales pocos meses despuŽs de haber superado la enfermedad (14, 15).

La variabilidad individual en los s’ntomas que cursan los pacientes con malaria cerebral refleja que, a pesar de utilizar criterios mŽdicos estandarizados para su diagn—stico, es un s’ndrome cl’nico heterogŽneo (16). La irritabilidad, inquietud o comportamiento psic—tico pueden ser los primeros signos de compromiso cerebral (17). Posteriormente pueden observarse convulsiones, incremento del tono muscular, hiperreflexia, clonus, rigidez, postura extensora, reflejos de extensi—n plantar, movimientos oculares y cambios en la pupila, mirada divergente, pŽrdida de la conciencia y coma (7, 8, 18, 19). Por œltimo, la aparici—n de acidosis metab—lica causada por una insuficiencia renal aguda, por acidosis l‡ctica o por ambas; as’ como hipoglucemia, anemia, ictericia, acidosis respiratoria y edema pulmonar (8, 9, 13, 18, 20) son tambiŽn rasgos colaterales que se asocian a esta afecci—n grave de malaria.

De todas las poblaciones con riesgo a sufrir MC los da–os cognitivos a largo plazo son m‡s habituales en ni–os del çfrica subsahariana (11, 21), y entre ellos se incluyen dŽficits en las ‡reas de la memoria, atenci—n y des—rdenes del lenguaje, problemas de comportamiento, da–os en la visi—n, audici—n y tacto, pero tambiŽn epilepsia y disfunciones motoras, como ataxia y par‡lisis (11, 13, 15, 18, 21), siendo m‡s graves en aquellos casos que han sufrido un coma profundo (11). Los da–os neurol—gicos pueden manifestarse durante la fase de recuperaci—n, o bien pueden desarrollarse m‡s tarde (15). Muchas veces las secuelas menos graves se hacen m‡s aparentes segœn el ni–o avanza en edad y, de hecho, el da–o cognitivo parece agravarse en el tiempo (14, 15).

El tratamiento actual para la malaria severa y cerebral consiste en la administraci—n inmediata, y a dosis elevadas, de antimal‡ricos por v’a parenteral con el objetivo de disminuir r‡pidamente la parasitemia, evitando as’ la muerte del paciente. Los f‡rmacos aprobados y actualmente disponibles para dicho tratamiento son los alcaloides de quinina (quinina y quinidina) y los derivados de la artemisina (artesunato, artemeter, artemotil) (22). No obstante, dentro de las recomendaciones terapŽuticas establecidas por la WHO se dejan en un segundo plano la prevenci—n de las secuelas o el recrudecimiento de la enfermedad, posiblemente debido al desconocimiento que aun existe sobre las causas del da–o cognitivo a largo plazo y la falta de informaci—n o de estudios cl’nicos en relaci—n a terapias que minimicen dicho da–o (23, 24).

El estudio del progreso de la infecci—n en humanos est‡ fundamentalmente limitado a muestras post m—rtem las cuales son de dif’cil adquisici—n. Esta limitaci—n hace de los modelos animales una herramienta necesaria en los estudios experimentales de la progresi—n de MC, los cuales aunque no reproducen en su totalidad las caracter’sticas patol—gicas expresadas en el hombre (9), permiten el an‡lisis m‡s detallado de los cambios ocurridos durante la infecci—n cerebral (19, 25). El modelo experimental m‡s aceptado en numerosos laboratorios para el estudio de la MC es el que utiliza la infecci—n de ratones de la estirpe C57BL/6 con P. berghei ANKA (9, 26). Dicho modelo ha sido muy explotado para identificar los mecanismos implicados en la patogŽnesis de esta infecci—n cerebral, sin embargo ha sido poco utilizado para evaluar la eficacia de posibles tratamientos farmacol—gicos espec’ficos para malaria cerebral y en terapias de rescate que prevengan los da–os cognitivos ocasionados (27-29). Esto es debido a las diferencias intr’nsecas del propio modelo para manifestar los rasgos cl’nicos que se desarrollan comœnmente en la malaria cerebral humana, por lo que resulta dif’cil establecer estadios claros de evoluci—n durante el avance de la patolog’a, obstaculizando as’ la elaboraci—n de protocolos de tratamiento efectivos y la evaluaci—n cl’nica y bioqu’mica del individuo durante y despuŽs de la infecci—n (9, 30).

2. MATERIAL Y MƒTODOS

Todos los experimentos fueron realizados en la Universidad Complutense de Madrid de acuerdo a las directrices del Consejo Internacional para Animales de Experimentaci—n.

2. 1. Modelo animal e infecci—n experimental

En todos los ensayos realizados en el presente trabajo se ha utilizado como modelo experimental de malaria cerebral la infecci—n de ratones macho de la cepa C57BL/6 (Harlan IbŽrica, Barcelona, Espa–a) de 4-5 semanas de edad con el par‡sito Plasmodium berghei (ANKA), el cual es capaz de inducir el desarrollo de malaria cerebral en los animales infectados en un tiempo de 7 a 14 d’as. En los grupos experimentales la infecci—n se inicia mediante la inyecci—n intraperitonial de los ratones con 5x106 gl—bulos rojos infectados con P. berghei (ANKA) procedentes de un rat—n donante de la cepa BALB/c, ya que esta cepa desarrolla parasitemias sangu’neas m‡s elevadas y permite reducir el nœmero de animales donantes. A los ratones del grupo control no se les infecta y se les inyecta una diluci—n equivalente de eritrocitos sanos de la misma cepa de rat—n BALB/c. Dado que diversos estudios sugieren que los par‡sitos son incapaces de producir suficiente ‡cido paraaminobenzoico (PABA) para sobrevivir tras la infecci—n (31) se a–adi—, en el agua de bebida, PABA a una concentraci—n del  0,05%.

2.2. Valoraci—n cl’nica del desarrollo de malaria cerebral en el modelo murino

El progreso de la infecci—n fue analizado diariamente en todos los ensayos in vivo mediante la determinaci—n de los niveles de parasitemia en sangre perifŽrica utilizando frotis sangu’neos, te–idos con la soluci—n de WrightÕs (Merck) seguido del contaje al microscopio de los eritrocitos infectados. Las alteraciones neurol—gicas asociadas a MC fueron establecidas tambiŽn diariamente mediante par‡metros definidos por el protocolo SHIRPA de evaluaci—n del comportamiento (32). As’, mediante la observaci—n detallada de los animales, se valor— la presencia de erizamiento del pelo, temblor, baja respuesta a est’mulos, par‡lisis, lateralizaci—n, desviaci—n de la cabeza, vueltas sobre s’ mismo, ataxia, elevaci—n de las patas traseras y convulsiones. La capacidad de movimiento de los ratones fue analizada aplic‡ndoles un test de frecuencia motora descrito previamente (32, 33). Adem‡s de los s’ntomas neurol—gicos, se determin—, en d’as alternos, la concentraci—n de hemoglobina en sangre durante el progreso de la infecci—n, usando el reactivo de Drabkin (34) (SIGMA-Aldrich).

2.3. Ensayo de permeabilidad de la barrera hematoencef‡lica (BHE)

El an‡lisis de la integridad de la BHE se realiz— inyectando intraperitonealmente a los ratones 200µL de soluci—n de Evans Blue (35) al 2% en soluci—n salina. Una hora m‡s tarde se sacrifican los animales mediante dislocaci—n cervical y se les extrae el cerebro para observar, de acuerdo al grado de tinci—n azul del tejido cerebral, el posible da–o en la permeabilidad de la barrera.

2.4. Tratamiento antimal‡rico con Artesunato en el modelo murino de malaria cerebral

La terapia con Artesunato en el modelo experimental de MC utilizado se llev— a cabo administrando 5 œnicas dosis del f‡rmaco bajo una pauta de orden diaria (OD). El tratamiento se inici— en los ratones infectados cuando manifestaban signos y s’ntomas claros de una malaria cerebral est‡ndar (EMC) y en los ratones que no desarrollaban MC, cuando estos presentaran s’ntomas graves de decaimiento general, con ciertas similitudes al momento elegido en los animales con EMC, pero en ausencia de s’ntomas de deterioro neurol—gico. A todos los animales seleccionados se les administr— una dosis de 32mg artesunato/kg de peso disuelto en bicarbonato de sodio al 5% (grupo Artesunato). Los grupos control del tratamiento para cada fenotipo de la enfermedad recibieron soluci—n de bicarbonato de sodio al 5% siguiendo la misma pauta de administraci—n (veh’culo) (Figura 1).

Figura 1.- Esquema del tratamiento antimal‡rico con Artesunato.

La eficacia de la terapia farmacol—gica administrada se determin— mediante la valoraci—n del curso y/o reversi—n de la enfermedad tras el tratamiento en los distintos grupos de animales, utilizando los test y mŽtodos mencionados en la estandarizaci—n del modelo.

3. RESULTADOS

 3.1. Caracterizaci—n cl’nica del modelo murino de malaria cerebral

Las investigaciones sobre el curso de la infecci—n mal‡rica cerebral no es posible llevarlas a cabo en humanos por lo que, a pesar de sus imperfecciones, se hace necesario el uso de modelos animales. Aunque el modelo murino de ratones C57BL/6 infectados con Plasmodium berghei ANKA tiene limitaciones, es el que actualmente presenta mayores similitudes con la patolog’a humana (9, 26).

El estudio detallado del progreso de la infecci—n mediante cuantificaci—n de la parasitemia y pruebas neurol—gicas llevado a cabo en este trabajo puso de manifiesto la heterogeneidad del modelo al momento de expresar o no s’ntomas neurocognitivos y motores asociados a MC. Debido a esta heterogeneidad fenot’pica observada durante el curso de la enfermedad, clasificamos a los animales en dos grandes grupos, segœn las diferencias en los valores de parasitemia, expresi—n de s’ntomas neurol—gicos y curso de la enfermedad. En el grupo de malaria cerebral est‡ndar (EMC), quedaron incluidos los animales infectados que expresaban un fenotipo cl’nico propio de malaria cerebral, caracterizado por el deterioro neurol—gico progresivo en ausencia de elevadas parasitemias. Aquellos ratones que desarrollaron parasitemias m‡s altas a las obtenidas por EMC, con ausencia de da–o neurol—gico y otros par‡metros asociados a la patolog’a cerebral, se incluyeron en el grupo de ratones sin malaria cerebral (SMC).

Los ratones del grupo que desarrollaron EMC mostraron cambios cl’nicos progresivos, que comenzaron con la expresi—n de s’ntomas tempranos de infecci—n mal‡rica seguida de signos claros de da–o neurol—gico que iban aumentando en severidad segœn progresaba la infecci—n (Figura 2).

Figura 2.- Identificaci—n de estadios neurol—gicos en la MC. A, controles. B, ratones sin s’ntomas neurol—gicos. Estadio I. C, Rat—n con s’ntomas neurol—gicos incipientes propios del Estadio II (Lateralizaci—n o hemi-par‡lisis), D, S’ntomas anteriores remarcados en el Estadio III. E, Los s’ntomas neurol—gicos empeoran en el Estadio IV con inclusi—n de par‡lisis severa. F, Heterogeneidad en la progresi—n de la MC observada en 3 ratones (barras horizontales) dentro de un mismo grupo experimental. La barra vertical representa la heterogeneidad del estado general del rat—n en el tiempo espec’ficamente en el d’a 6 post-infecci—n. G, % de parasitemia promedio durante cada estadio y el tiempo (d’as p.i.) promedio de expresi—n en el curso de la infecci—n.

Por ello, en los animales con EMC definimos 4 estadios de gravedad atendiendo a su fenotipo neurol—gico (video 1). En el estadio I, que coincide con los primeros d’as de infecci—n, los animales se comportaron como los del grupo control, no manifiestaron s’ntomas neurol—gicos, aunque con parasitemias entre el 1-2% (Figura 2B), por lo que se defini— como asintom‡tico. En el estadio II (Figura 2C) los ratones presentaron s’ntomas incipientes propios de MC como desviaci—n de la cabeza o hemipar‡lisis. En este momento, algunos animales del grupo tambiŽn expresaron erizamiento del pelo, temblor y giros sobre s’ mismos. Los niveles de parasitemia aumentaron, alcanzando valores entre un 8-10% (Figura 2G), y la frecuencia motora disminuy— progresivamente (Figura 3B1). A partir del estadio II, los s’ntomas neurol—gicos se agravaron r‡pida y progresivamente dando lugar a la aparici—n de los estadios III y IV. En el estadio III las manifestaciones de da–o neurol—gico (Figura 2D) son m‡s evidentes (desviaci—n de la cabeza, hemipar‡lisis/par‡lisis, elevaci—n pŽlvica, temblor y disminuci—n notable de la frecuencia motora) (Tabla 1) y la parasitemia alcanz— valores entre un 10 a un 15% (Figura 2G). Finalmente, en el estadio IV se observaron los s’ntomas m‡s severos y evidentes de la MC (Figura 2E), incluyendo grave desviaci—n de la cabeza, hemipar‡lisis/par‡lisis aguda, temblor intenso con total erizamiento del pelo, poca o nula respuesta a est’mulos, frecuencia motora sin actividad y presencia de convulsiones que pueden conducir a un estado comatoso y la muerte del animal (Tabla 1). Durante los œltimos instantes del estadio III y en el transcurso del IV se observaron en algunos animales signos comunes de retinopat’a, otro de los par‡metros de diagn—stico asociados a MC. En esta œltima etapa la parasitemia alcanz— valores m‡ximos de hasta un 18% (Figura 2G).

Tabla 1.- S’ntomas y signos cl’nicos observados durante el progreso de la infecci—n en ratones con EMC y sin MC. Se muestran los s’ntomas no neurol—gicos expresados en los diferentes estadios de EMC y en ratones sin MC como: presencia o  Ausencia, y los s’ntomas neurol—gicos manifestados en MC por severidad (I: Incipiente, A: Apreciable y S: Severo), junto a los porcentajes de los ratones que expresaron dichos s’ntomas. no: sin manifestaci—n.

   

Ratones con ECM

Ratones  sin MC

Signos - S’ntomas

Estadio I

Estadio II

Estadio III

Estadio IV

PLAP/PRAP

Parasitemia

Erizamiento del pelo

Disminuci—n de la frecuencia motora

Elevaci—n pŽlvica

Temblor

Anemia

Desviaci—n de la cabeza

no

1/20%

1/35% - A/65%

A/77% - S/33%

no

Par‡lisis

no

1/45%

A/83%

S/100

no

Convulsiones

no

0%

34%

63%

no

Coma

no

0%

0%

<50%

no

Cabe destacar que las manifestaciones cl’nicas individuales observadas durante el progreso de la malaria cerebral no se presentaron al mismo tiempo en todo los animales del grupo experimental (Figura 2F). Los s’ntomas de infecci—n por Plasmodium suelen aparecer a los pocos d’as post-infecci—n (2-5 d.p.i), mientras que los primeros s’ntomas asociados a MC (estadio II) suelen aparecer entre 12 y 24 h. despuŽs. Por ello, y considerando que la sintomatolog’a neurol—gica del estadio II es leve, el diagn—stico de la MC puede establecerse, inequ’vocamente, cuando los animales han alcanzado el estadio III, el cual aparece transcurridas de 6 a 24 h. desde el estadio anterior. La progresi—n de la infecci—n por MC condiciona una supervivencia que no supera los 12 d’as post-infecci—n.

Durante el desarrollo de la infecci—n tambiŽn se observaron animales que presentaban niveles de parasitemia y tiempos de supervivencia muy diferentes a los expresados por los animales del grupo EMC, por lo que se clasificaron como animales que se infectan por Plasmodium pero no desarrollan malaria cerebral, mostrando un fenotipo cl’nico diferente (SMC). Un 55% de los ratones del grupo SMC mostraron una progresi—n de la infecci—n lenta y valores altos de parasitemia (PLAP). Estos animales presentaron porcentajes de parasitemia inicialmente bajos (Å 10% hasta el d’a 10 p.i.), similares a los que cursan con MC, pero que aumentan significativamente llegando a alcanzar niveles muy superiores (Å 60%) a los descritos para MC est‡ndar (Figura 3A2). En este grupo el desarrollo de la infecci—n result— mucho m‡s lento por lo que el periodo total p.i. fue m‡s amplio y los animales fallecen 15 d’as despuŽs de ser infectados. El resto de los ratones incluidos en el grupo SMC fueron definidos como grupo PRAP ( 45%) porque presentaban una progresi—n de la infecci—n mucho m‡s r‡pida que los anteriores, alcanzado valores de hiperparasitemia (>40%) antes de los 4 d’as p.i. (Figura 3A3), lo que produjo su muerte en la primera semana p.i.

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Figura 3.- Diferencias biol—gicas, motoras y hematol—gicas entre los distintos grupos experimentales (1. EMC, 2. PLAP y 3. PRAP) durante la caracterizaci—n del modelo experimental: (A) Parasitemia (%) (B) Frecuencia motora (%) y (C) Hemoglobina (%). El valor de parasitemia (%) est‡ representado como el promedio de los valores diarios de cada rat—n ± SEM. La variaci—n de la frecuencia motora del animal se expresa en % y representa el promedio de la diferencia que se obtiene para cada rat—n con respecto al valor inicial (100%) ± SEM. La concentraci—n de hemoglobina se expresa en % y representa la media de los valores obtenidos para cada rat—n en mg/ml y su diferencia con respecto al valor inicial (100%) ± SEM.

3.2. Concentraci—n de hemoglobina en sangre

La concentraci—n de hemoglobina en sangre de los ratones infectados se determin— a lo largo del ensayo en d’as alternos. Los resultados obtenidos durante la infecci—n (Figura 3C) mostraron que existe una relaci—n entre los datos de hemoglobina y el tipo de progresi—n e infecci—n que cursa el rat—n. As’, los ratones del grupo con EMC presentaron valores de hemoglobina (Hb) pr‡cticamente constantes durante el proceso infectivo (Figura 3C1), mientras que en aquellos que no desarrollaron la infecci—n cerebral, PLAP y PRAP, (Figura 3C2 y C3) la concentraci—n de Hb disminuy— al 50% en la primera semana p.i., debido, posiblemente, a la anemia que sufren como consecuencia de la hiperparasitemia que alcanzan estos dos grupos.

3.3. Permeabilidad de la barrera hematoencef‡lica (prueba del EvanÕs Blue)

   El cambio de la permeabilidad de la BHE secundario al secuestro de la microvasculatura  (18, 36, 37) explica el edema cerebral que frecuentemente acompa–a a la malaria cerebral. Con el fin de evaluar si las anormalidades en la BHE se asocian a la evoluci—n cl’nica de la patolog’a cerebral procedimos a valorar la integridad de la misma en el modelo murino clasificado por estadios, utilizando el test de coloraci—n con la soluci—n de ÒEvanÕs BlueÓ. Como se muestra en la figura 4A, el tejido cerebral extra’do de los ratones del grupo MC adquiri— la coloraci—n azul propia de la tinci—n utilizada indicativa del da–o en la funci—n de la barrera hematoencef‡lica. La alteraci—n en la BHE aument— a medida que progresaba la patolog’a cerebral. En la figura 4 se observa que, en el primer estadio, asintom‡tico, la BHE est‡ aœn funcional, siendo impermeable a la entrada de la soluci—n de tinci—n, pero dicha permeabilidad cambia segœn progresa el cuadro cl’nico neurol—gico, detect‡ndose ya en el estadio II entrada del colorante al tejido cerebral, lo que se relaciona con el inicio de los s’ntomas de la MC. La ruptura m‡s severa en la BHE se detect— en el estadio IV, donde el cerebro adquiri— una intensa coloraci—n azul, siendo ese momento cuando los animales manifestaron los s’ntomas m‡s graves de MC como convulsiones o el coma. En la misma figura se muestran cuatro cerebros que fueron extra’dos de los animales pertenecientes a los otros dos grupos de infecci—n caracterizados, dos del grupo PLAP (Figura 4C) y dos del grupo PRAP (Figura 4B), y tratados de la misma forma con la soluci—n de EvanÕs Blue. Como se puede observar en las im‡genes, en ninguno de estos casos aparecen evidencias de ruptura de la BHE, ya que no hay acumulaci—n de coloraci—n azul en el parŽnquima cerebral, comport‡ndose igual que la muestra del control sano. El cerebro de los animales del grupo PLAP, fue extra’do entre el d’a 10 y 12 p.i., y en el grupo PLAP las muestras se tomaron en el d’a 6 p.i., cuando presentaban altos niveles de parasitemia, s’ntomas de decaimiento general y anemia severa.

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Figura 4.- Fotograf’as de cerebros murinos tratado con la soluci—n EvanÕs Blue. A. Cerebros tomados en los diferentes estadios observados en el transcurso est‡ndar de la Malaria Cerebral. Estadio I o sin MC: rat—n sin s’ntomas neurol—gicos evidentes. Estadio II: rat—n con s’ntomas neurol—gicos incipientes. Estadio IV: Rat—n con s’ntomas graves de MC (Coma). B. Cerebros del grupo PRAP, extra’dos entre el d’a 10-12 p.i. C. Cerebros del grupo PLAP, extra’dos entre el d’a 5-6 p.i.

3.4. Efecto del tratamiento con Artesunato sobre el curso de la malaria cerebral en el modelo de fases cl’nicas

   Para comprobar la eficacia del modelo de malaria cerebral clasificado en estadios de afectaci—n, en estudios de terapia antimal‡rica y adyuvante, se evalœo el efecto del artesunato, droga de elecci—n en el tratamiento de la malaria severa, administrado en monoterapia segœn las pautas y dosis detalladas en el apartado 3.4 de materiales y mŽtodos. El tratamiento de los ratones que sufren EMC se inici— en el estadio III, cuando se establec’a un diagn—stico inequ’voco de MC mediante la evaluaci—n de sus capacidades neurol—gicas utilizando distintos test y determinaciones biol—gicas-hematol—gicas previamente seleccionados durante la caracterizaci—n cl’nica del modelo. De esta forma, el tratamiento farmacol—gico se dirige espec’ficamente a la infecci—n cerebral. Una vez iniciada la administraci—n del f‡rmaco se ensayaron los mismos par‡metros utilizados para definir los estados cl’nicos del modelo y valorar as’ la eficacia del tratamiento durante el curso de la infecci—n.

   Con el fin de evaluar tambiŽn el efecto de la misma terapia con artesunato en aquellos animales del grupo experimental que no desarrollaban MC, se extendi— este estudio antimal‡rico a aquellos ratones que desarrollaron la infecci—n, pero sin manifestar signos asociados a MC. Estos animales se trataron siguiendo la misma pauta terapŽutica que la descrita para el grupo anterior. En este caso, y dado que no pod’a elegirse el inicio del tratamiento segœn el estadio neurol—gico en que se encontraban los animales, este se comenz— en el momento en el que los ratones presentaron s’ntomas graves de decaimiento, similares a un estadio III en EMC, pero sin signos de afectaci—n neurol—gica.

Un esquema del tratamiento aplicado y los resultados obtenidos se muestra en la figura 5. En el grupo de ratones que manifest— EMC la administraci—n del f‡rmaco consigui— detener el crecimiento del par‡sito y el proceso infectivo, como demuestran los resultados de parasitemia alcanzados (Figura 6A2), con la recuperaci—n temporal de los valores en los par‡metros ensayados (Figura 6B2 y C2), lo que se tradujo en un aumento del tiempo de supervivencia de los animales hasta alcanzar 15 d’as p.i. Sin embargo, el efecto antimal‡rico del artesunato no fue suficiente para conseguir eliminar completamente los par‡sitos circulantes, ya que a partir del cuarto d’a de tratamiento, la parasitemia vuelve a incrementarse detect‡ndose una clara recrudescencia de la infecci—n (Figura 6A2) que provoca la muerte de los ratones debido a la anemia severa que sufren como consecuencia de los altos niveles de par‡sitos en sangre alcanzados.

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Figura 5.- Dise–o del tratamiento antimal‡rico y sus efectos en el transcurso de la infecci—n. Se indican los resultados del tratamiento con Artesunato sobre la supervivencia y rescate de ratones con MC y sin MC en el modelo descrito. Sin efecto: Muerte del animal. Efectivo*: inhibici—n parcial de la infecci—n con posterior recrudescencia. ---- Aumento de la supervivencia.

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Figura 6.- Efecto del tratamiento con Artesunato sobre los par‡metros biol—gicos, motores y hematol—gicos evaluados durante la infecci—n con MC. El valor de la parasitemia (%) est‡ representado como el promedio de los valores diarios por grupo ± SEM. La variaci—n de la frecuencia motora se expresa en %, representando el promedio de la diferencia en porcentaje que tiene cada rat—n con respecto al valor inicial (100%) ± SEM. Hemoglobina expresada en %, representada como el promedio de los valores de cada rat—n en mg/ml y su diferencia en porcentaje con respecto al valor inicial (100%) ± SEM. A. % Parasitemia para el grupo control y EMC. B. Variaci—n de la frecuencia motora para el grupo control y EMC y C. Variaci—n de hemoglobina para el grupo control y EMC. ↑↑↑ D’as de inicio de tratamiento (7-9 p.i.).

En el caso de los ratones sin MC y tratados de la misma forma que los anteriores, la infecci—n no se vio afectada en ningœn punto por el f‡rmaco y el 100% de los animales sigui— la progresi—n de la misma, muriendo por anemia severa producto de los altos niveles de parasitemia adquiridos (Figura 7). Los ratones con EMC o sin MC tratados con bicarbonato al 5% no presentaron cambios durante el progreso de la infecci—n, y murieron a causa de la MC o de anemia severa, respectivamente (Figura 6A1).

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Figura 7.- Resultados del tratamiento con Artesunato en ratones infectados que no desarrollan MC (PLAP-PRAP). La parasitemia (%) representada como el promedio de los valores en % de cada rat—n ± SEM. A1. Parasitemia de ratones infectados con PLAP y tratados con Artesunato 32 mg/kg. D’as del inicio de tratamiento (11-12 p.i.). A2. Parasitemia de ratones infectados con PRAP y tratados con Artesunato 32 mg/kg. D’as del inicio de tratamiento (6-7 p.i.).

4. discusi—n

A pesar de la controversia que existe respecto a su validez, los modelos animales constituyen una herramienta imprescindible y extraordinariamente œtil para el estudio del desarrollo de la malaria cerebral (26, 38), siendo los modelos murinos los de elecci—n en la investigaci—n experimental de la patolog’a in vivo. Aunque existen diferencias entre la patolog’a humana y murina, son muchos los estudios que destacan las numerosas similitudes que tiene la infecci—n de ratones de la estirpe C57BL/6 con P. berghei ANKA con el desarrollo de la enfermedad en el hombre (25, 26). No obstante, este modelo, ampliamente utilizado para el estudio de la patolog’a cerebral, ha sido poco explotado en ensayos de terapia antimal‡rica y de terapias adyuvantes que puedan ser neuroprotectoras y que contribuyan al rescate de las secuelas neurol—gicas. Ello es, posiblemente, debido a la complejidad que el modelo presenta en relaci—n a la heterogeneidad de s’ntomas y el tiempo de expresi—n de los mismos, y a que aœn no se conocen por completo las secuencias de eventos cl’nicos y moleculares que acontecen en el hospedador  (26-28, 38). Al igual que sucede en pacientes que sufren MC (8, 16, 26, 36), esta heterogeneidad entre individuos durante el transcurso de la infecci—n representa un problema para el diagn—stico de la enfermedad, dificultando enormemente la administraci—n de una terapia espec’fica y eficaz para la infecci—n cerebral, que conduce en muchas ocasiones a un da–o cerebral irreversible o la muerte del paciente (8, 9, 22).

La mayor’a de los estudios sobre MC llevados a cabo con este modelo definen la severidad de la enfermedad y sus manifestaciones en tŽrminos de d’as post-infecci—n (19, 26). Sin embargo, debido a la diferencia temporal que presentan los animales en la aparici—n de los primeros s’ntomas y en el propio progreso de la infecci—n, unido a que no todos los ratones infectados desarrollan la infecci—n cerebral, parece m‡s indicado clasificar a los animales de acuerdo a las manifestaciones fenot’picas neurol—gicas que van adquiriendo. Utilizando este œltimo criterio, esta investigaci—n pone de manifiesto la ventaja de agrupar los eventos neurol—gicos que suceden en la MC en estadios (I-IV), cada uno de ellos con cambios y expresi—n de s’ntomas y signos regulares, mediante la evaluaci—n constante de funciones neurocognitivas, biol—gicas y motoras del animal, estandarizando as’ un protocolo anal’tico que, adem‡s, permita la identificaci—n precisa de los individuos que desarrollan la infecci—n cerebral de aquellos que no lo hacen.

Varios de los s’ntomas asociados a MC descritos por otros autores (19, 26) fueron observados en los animales de nuestro ensayo con EMC; sin embargo, el momento de expresarlos fue distinto en cada individuo. Los signos incipientes aparecieron en el d’a 6-7 p.i., mientras que los s’ntomas m‡s graves se observaron entre las 6-30 h posteriores.

Junto a estos animales se identificaron y caracterizaron ratones que desarrollaban una infecci—n mal‡rica pero sin las caracter’sticas de la patolog’a cerebral, los cuales presentaban a su vez progresiones de infecci—n distintas y con parasitemias que pod’an llegar al 70%. Esta heterogeneidad tambiŽn es propia de la MC humana, donde solo entre el 2 y el 5% de los ni–os infectados desarrollan la forma cerebral  (13, 15, 18). Esta nueva caracterizaci—n del modelo murino permite disminuir la variabilidad fenot’pica, producto de la heterogeneidad en la experimentaci—n, y pone de manifiesto la necesidad de establecer un buen diagn—stico de MC despuŽs de la infecci—n que facilite la evaluaci—n de tratamientos farmacol—gicos que puedan generar resultados m‡s confiables y precisos.

El artesunato es actualmente la droga m‡s potente, aprobada y establecida para ser la primera opci—n de tratamiento en adultos y ni–os con malaria severa producida P. falciparum. Se ha demostrado que el artesunato es capaz de inhibir tanto las formas maduras como las j—venes del par‡sito y de ah’ su versatilidad (22, 39). Su acci—n antiplasm—dica sobre P. berghei ANKA tambiŽn ha sido descrita (40) y recientemente se ha visto un posible efecto de rescate sobre secuelas neurol—gicas en ratones que se recuperan de la MC (27). Por todo ello, en este trabajo se evalu— la capacidad antimal‡rica del artesunato utilizando nuestro modelo de MC organizado en estadios de afectaci—n para seleccionar el comienzo del tratamiento de forma que se dirigiera espec’ficamente a los animales con malaria cerebral. As’, la administraci—n del f‡rmaco se inici— exclusivamente en los ratones que estaban en el estadio III de EMC, manifestando claramente los s’ntomas y signos propios de infecci—n cerebral. Los resultados demostraron la capacidad antimal‡rica del artesunato, logrando detener el progreso infecci—n y sus s’ntomas desde la primera dosis del tratamiento. Sin embargo, este efecto fue solo temporal, apareciendo un cuadro grave de recrudescencia de la infecci—n 4 d’as despuŽs de iniciado el tratamiento. Resultados similares fueron obtenidos previamente por otros autores (Gumede y col. 2003, Clemmer y col.) que demostraron que el artesunato administrado oral e intraperitonealmente en el mismo modelo experimental murino inhibe el crecimiento de P. berghei ANKA, pero induce una gran recrudescencia de la infecci—n (27, 40). Cabe destacar que el inicio de la terapia en dicho estudio se realiz— en todos los animales a la vez, seleccionado el d’a post infecci—n y no de acuerdo a la manifestaci—n cl’nica de la enfermedad. De esta forma su tratamiento se aplica en el d’a 6 p.i, cuando los ratones expresaban s’ntomas muy leves a nivel motor. En cualquier caso, una terapia con artesunato en dosis m‡s altas y en tiempo m‡s prolongado podr’a ser suficiente para inhibir completamente la infecci—n y evaluar el efecto de rescate en las secuelas residuales. Por otro lado, el tratamiento con el f‡rmaco en aquellos ratones de nuestro ensayo que progresaron en la infecci—n sin desarrollar MC no tuvo efecto antim‡larico alguno, provocando la inevitable muerte del animal por anemia en pocos d’as. Es por tanto que esta nueva clasificaci—n del progreso de la malaria cerebral en estadios agrupados, en funci—n de la gravedad del cuadro neurol—gico de los individuos infectados, resulta esencial para llevar a cabo estudios que ayuden a elucidar los procesos patol—gicos y cl’nicos claves de la enfermedad humana, reduciendo al m’nimo la variabilidad producida por la heterogeneidad en el desarrollo de la malaria experimental murina.

5. conclusioneS

La nueva disecci—n del modelo murino de malaria cerebral con P. berghei ANKA y ratones C57BL/6 mediante la evaluaci—n combinada de par‡metros biol—gicos, hematol—gicos y neurol—gicos permitir‡ abordar estudios farmacol—gicos de eficacia de terapias antimal‡ricas y de rescate de secuelas neurocognitivas y motoras de forma espec’fica durante el transcurso de infecci—n cerebral.

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